1.1.3.2. Centrifugación diferencial.
        La centrifugación es un método que utiliza la propiedad de sedimentación de partículas con base en la masa de las moléculas para la separación de partículas de una solución. Una vez obtenido el lisado o homogenado celular se ha de proceder a su fraccionamiento. Una de las técnicas más empleadas es la centrifugación. Se basa en hacer girar el tubo a gran velocidad de forma que se produzca la acumulación en el fondo del mismo de las partículas que tienden a hundirse por tener una densidad menor que la del medio en que se encuentran. Así, después de la centrifugación la muestra, homogénea, se habrá separado en dos fracciones : sobrenadante (supernatant), fracción homogénea que no ha sedimentado, y el sedimento (pellet) que ha quedado adherida al fondo del tubo.
        La fuerza centrífuga es aplicada a cada partícula de la muestra la cual será sedimentada en un índice que es proporcional a la fuerza centrífuga aplicada.

Centrífuga
    Las centrífugas son instrumentos que permiten someter a las muestras a intensas fuerzas que producen la sedimentación en poco tiempo de las partículas que tienen una densida mayor que la del medio que las rodea. En general se diferencian en función de los márgenes de aceleración a que someten a las muestras en : centrífugas (de pocas g a aprox. 3000 g), super-centrífugas (o centrífugas de alta velocidad, rango de 2000 g a 20000 g) y ultracentrífugas (de 15000 g a 600000 g). En las centrífugas se suele controlar la temperatura de la cámara para evitar sobrecalentamiento de las muestras debido a la fricción. En las ultracentrífugas, la velocidad extrema (más de 100000 rpm), hace que sea necesario hacer un intenso vacio en la cámara de la centrífuga para evitar el calentamiento de rotor y muestra.
    En una centrífuga el elemento determinante es el rotor, dispositivo que gira y en el que se colocan los tubos. Existen varios tipos :

Los parámetros a tener presentes en cualquier centrifugación, que determinarán las condiciones son :


    Todo rotor tiene unas propiedades que determinan las condiciones en que se podrá centrifugar la muestra. Son especialmente importantes el ángulo de giro, el radio mínimo, medio y máximo, y la velocidad máxima de giro. La relación entre la velocidad de giro, medida en revoluciones por minuto (rpm) y la fuerza de aceleración (fuerza centrífuga relativa, RCF : relative centrifuge force) a que se somete la muestra (g) se recoge en la expresión siguiente :

RCF = 1.118 * 10-5 * r * (rpm)2
NOTA: Si usted desea conocer el valor en gravedades de las rpm, se aplica la fórmula de fuerza de centrifugación relativa:

Centrifugación diferencial
    La centrifugación diferencial se basa en la existencia de diferentes partículas en la suspensión que difieren en su densidad de la del medio. Si se centrifuga en condiciones suaves (poco tiempo, poco fuerza de aceleración) sedimentarán las partículas mayores y/o más densas. Cuando el sobrenadante de la primera centrifugación es centrifugado de nuevo en condiciones de mas tiempo y más fuerza de aceleración sedimentan de nuevo las partículas más densas presentes  y así sucesivamente. Se pueden aplicar condiciones crecientes de severidad en la centrifugación y obtener una colección de sedimentos que corresponden sucesivamente a fracciones de partículas de diferente tamaño y/o densidad.

SEDIMENTACION
        La sedimentación es el transporte de partículas en un campo de fuerza de centrifugación. Permite determinar peso molecular, densidad y forma de macromoléculas y organelos celulares.

Coeficiente de sedimentación
        Los principios básicos de la teoría de sedimentación, se originan de la ley de Stokes, la cual fue creada para medir la sedimentación de una esfera en un campo gravitacional, para así mostrar que la velocidad de la esfera alcanza un valor constante y la fuerza neta en esta es igual a la fuerza de resistencia de este movimiento a través del líquido.

Coeficiente de sedimentación 1 dr S = ----- X ------
                                                                    W2 r dt

W : velocidad del rotor
Dr/dt : índice de movimiento de dos partículas (cm/s)

Velocidad de sedimentación
    Alternativamente es posible aprovechar esa diferencia en la velocidad necesaria para sedimentar las partículas para realizar una centrifugación en un medio en el que exista un gradiente de densidad, siendo menor en la parte superior y mayor en la inferior. Después de un tiempo las diferentes poblaciones de partículas se sitúan en diferentes profundidades del tubo. Haciendo un pequeño orificio en el fondo del mismo se pueden recoger diferentes fracciones que contengan a las distintas poblaciones separadas.
    Este es el fundamente de la ultracentrifugación preparativa, que permite determinar la velocidad de sedimentación de una partícula (medida en unidades Svedverg, S).
        Los coeficientes de sedimentación son usualmente expresados en Sveldbergs (S) o 10-13s. De esta manera, una partícula cuyo coeficiente de sedimentación es medido en 10-12s.= 10x10-13s., es decir que tiene un valor de 10S.

Una partícula en un campo gravitacional se comporta según la LEY DE STOKES

                                d2 ( hP - hL )
                    V  =   ____________  x g
                                      18 n

Donde:   V = velocidad de sedimentación
              d  = diámetro de la partícula
           hP = densidad de la partícula
           hL = densidad del líquido
           n  = viscosidad del medio
              g  = fuerza gravitacional

Se cumple:
- La velocidad de sedimentación es proporcional al tamaño de la partícula
- La velocidad de sedimentación es proporcional a la diferencia entre la densidad del medio circundante y la densidad de la partícula
- La velocidad de sedimentación es 0, cuando la densidad de la partícula e igual a la densidad del medio circundante
- La velocidad de sedimentación disminuye  al aumentar la viscosidad del medio
- La velocidad de sedimentación aumenta al aumentar la fuerza del campo centrífugo
        El coeficiente de sedimentación es una constante caractéristica de cada organelo o macromolécula y sus unidades se dan en Svedvergs, tomando el nombre de su descubridor.
        El tiempo de centrifugación hasta la clarificación de una organela se define por:

                    K
T (horas) =  ---
                    S

Donde:  S= coeficiente de sedimentación de la organela
             K= constante del rotor. ( depende del ángulo de inclinación del tubo de centrifugación con respecto al eje de rotación)
 
 

Investigue como se utiliza un nomograma.





BIBLIOGRAFIA
Tood, Stanford. Diagnóstico y tratamiento clínico por el laboratorio. 1988. Salvat. Tomo I. Pág 14.
http://tecn.rutgers.edu/bio356/lectures/DNAprep.html
http://ginger.cc.utexas.edu/ithk310/sedimentation.html
http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/fraccionamiento.htm
 

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