1.1.3.5. Cromatografia
      La cromatografía puede definirse como una técnica que separa una mezcla de solutos basada en la velocidad de desplazamiento diferencial de los mismos que se establece al ser arrastrados por una fase móvil (líquida o gaseosa) a través de un lecho cromatográfico que contiene la fase estacionaria, la cual puede ser líquida o sólida. Las propiedades de los componentes de una mezcla determinan su movilidad entre sí y con respecto a la fase móvil. La base de la separación cromatográfica será, por tanto, la diferencia en la migración de los mismos.

1.1.3.5.1. Notas Históricas
    El botánico ruso Mijail Tswett estableció las ventajas de la técnica, adopto la terminología y definió los procedimientos experimentales básicos para esta técnica, se considera que es el Padre de la Cromatografía. En los años 30 y 40 empezó su desarrollo y aplicación en diferentes procedimientos de experimentación.

1.1.3.5.2. Principios
    La palabra Cromatografía significa EscribirenColores, porque cuando fue desarrollada los componentes separados eran colorantes. Se define como una técnica o método físico de separación basado en las diferentes velocidades con que se mueven los solutos disueltos en un disolvente  llamado eluente (fase móvil) a través de un medio estacionario o fijo. Los componentes a separar se distribuyen entre la fase estacionaria y la fase móvil o fluido que pasa a través o a lo largo de la fase estacionaria. Como los componentes de la mezcla presentan diferente tendencia a permanecer en cualquiera de las fases, la separación se da por el movimiento de la fase móvil en relación con la estacionaria y de la distribución de las sustancias entre las dos fases. Las moléculas que "prefieren disolverse" en la fase móvil serán eluídas más rápido que las que son preferencialmente solubles en la fase estacionaria y que tienden a quedar retenidas. En resumen se fundamenta en la separación entre la fase estacionaria sólida o liquida y la fase móvil liquida o gaseosa
    Los fenómenos rectores del proceso de retención y separación son la adsorción y la absorción. El primero queda delimitado a la superficie interfacial es decir se refiere a la fijación o retención de la sustancia entre la superficie de las dos fases; se relaciona con fuerzas químicas y físicas que dependen de  la naturaleza de la sustancia absorbida, temperatura, naturaleza del absorbente y concentración. El segundo fenómeno determina la retención de una especie química por parte de una masa y depende de la tendencia que tiene ésta a formar mezcla o reaccionar químicamente con la misma.

1.1.3.5.3. Clasificación de la Cromatografía
    Existen muchas maneras de clasificar los métodos cromatográficos, según su fase móvil se clasifica en  Cromatografía de gases que puede ser a través de dos sistemas, gas- líquido y gas-sólido y Cromatografía líquida donde el eluente es un líquido y puede ser líquido-liquido, liquido-sólido. Por el mecanismo de retención-separación, es decir el tipo de equilibrio implicado en la transferencia de los solutos entre las fases se encuentra la Cromatografía de reparto, de adsorción y de exclusión. Según la forma de contacto entre las fases se denomina de columna o superficie plana. También se puede clasificar teniendo en cuenta la fase estacionaria, la dimensionalidad, escala física y gradientes.

Técnicas cromatográficas
Según el dispositivo utilizado para conseguir el contacto entre la fase móvil y la estacionaria, se distinguen dos técnicas:
Columna 
Se usa un tubo cilíndrico 
Plana: El soporte es una placa plana o los intersticios de un papel 
Capa fina
Papel (partición)

3.1 Cromatografía en capa fina.
    Por este método se pueden analizar mezclas de aminoácidos. La muestra para análisis se aplica por medio de un tubo capilar en la superficie de una capa fina adsorbente en forma de banda, punto o mancha y es adsorbida en la superficie por la acción de fuerzas electrostáticas (Fuerzas de Van der. Waals, puentes de hidrogeno, efectos inductivos, etc). Los adsorbentes más  utilizados son gel de silica, alumina, tierra silícea, celulosa y poliamidas. Como soportes del adsorbente se utilizan laminas o placas de vidrio, plásticas o metálicas, algunas placas tienen indicador de fluorescencia : f254 ó f366.
    La placa seca se coloca en el tanque cromatográfico o cámara, en el cual debe encontrarse saturado el eluente (Fase Móvil líquida).El eluente ascenderá o desplazara por capilaridad en la placa y arrastrará los componentes a lo largo de ésta produciendo “manchas” que representan a los componentes, la separación se da por migración diferencial, es decir que la fase móvil arrastra a las substancias apolares y aquellas más polares son retenidas por la fase estacionaria dando lugar a la separación. Posteriormente se evapora el eluente y la placa se analiza  por medio de métodos químicos en el que por inmersión o rociado se obtienen derivados coloreados o fluorescentes (Adición de Ninhidrina a aminas, Ácido sulfúrico para carbonizar compuestos orgánicos, etc), o por medio de métodos físicos ópticos utilizando radiación UV o luz visible.
    El análisis es de tipo cualitativo, semicuantitativo o cuantitativo. En el primero se hacen comparaciones visuales de color e intensidad y propiedades UV entre otras. En el semicuantitativo se observa diámetro y comparación visual e intensidad del color de la mancha contra manchas patrones de concentración conocida. Y en la forma cuantitativa se pueden realizar medidas de transmisión a través de la sustancia y medidas de emisión o medida de luz reflejada desde la sustancia, y espectrofotometría por fluorescencia.

1.1.3.5.3.2 Cromatografía en papel.
    El proceso es básicamente el mismo, solo que se usan tiras de papel cromatográfico en el tanque cromatográfico.

1.1.3.5.3.3. Cromatografía en Columna.
    Se utilizan columnas de vidrio rellenas de Alúmina (Al2O3), Sílica u Oxido de Magnesio. La fase estacionaria esta constituida por un sólido poroso, el cual queda soportado en el interior de una columna generalmente fabricada en plástico o vidrio. La fase móvil se encuentra formada por la solución que lentamente va atravesando la fase estacionaria. La solución que sale al final de la columna se reemplaza constantemente por nueva solución que se suministra desde un contenedor por la parte superior de la columna.
    La migración de las sustancias de la mezcla a través de la columna se encuentra retardada en diferente grado por las interacciones diferenciales que cada una de ellas pueda ejercer con la fase estacionaria. Las sustancias se separan gradualmente formando bandas dentro de la banda total, la separación, y por tanto la resolución, aumenta con la longitud de la columna. La banda individual de cada sustancia puede ensancharse con el tiempo debido a procesos difusiónales, disminuyendo por tanto la resolución.

1.1.3.5.3.4. Cromatografía de gases.
    Se utiliza para la separación de sustancias gaseosas. La Fase Móvil es un Gas (llamado Gas Portador) y la Fase Estacionaria puede ser un sólido (Cromatografía Gas-Sólido) o una Película de líquido de alto punto de ebullición (Generalmente Polietilén-Glicol o Silicón) recubriendo un sólido inerte (Cromatografía Gas-Líquido). El cromatógrafo de gases esta constituido normalmente por un suministro y una entrada del gas portador, un puerto de inyección, una columna normalmente localizada en el interior de una cámara termostatizada (horno), un detector y un sistema computarizado para analizar, registrar e imprimir el cromatógrama.
    La muestra se introduce a través del sistema de inyección dentro de la columna que es el sitio donde ocurre la separación. La columna  de aluminio, acero inoxidable, vidrio o teflón  contiene la fase estacionaria sólida o líquida y esta sujeta a la superficie por un soporte que es generalmente de sílice. La fase móvil o gas portador transporta los componentes de la muestra a través de la columna, por esta razón debe ser inerte para evitar interacciones con la muestra o la fase estacionaria, y  ser capaz de minimizar la difusión gaseosa. Al final de la columna existe el detector que permite la detección y cuantificación de las sustancias,  midiendo conductividad térmica y electronegatividad de las sustancias eluídas. Se produce una señal tipo eléctrico, que posteriormente se amplifica por un registrador grafico o un integrador permitiendo indicar el momento en que salen de la columna los componentes.  La salida  de la sustancia se registra en un cromatógrama en forma de picos y se determinan medidas como la altura y el área del pico.

1.1.3.5.3.5.Cromatografía Liquida de alta eficiencia o rendimiento (HPLC).
    Es una Cromatografía de alta presión es decir se aplica el flujo a presión (entre 1500 a 2200 psi). El tamaño de partícula es entre 3 y 10 micras, la longitud de la columna es entre 5 y 25 cm. y requiere de equipo sofisticado. Se pueden analizar muestras proteicas. La reducción del tiempo en que la sustancia se encuentra en el interior de la columna, limita el ensanchamiento por difusión de las bandas, aumentando por tanto la resolución.
    El sistema HPLC requiere una mezcladora de solventes, un inyector, y una bomba que inyecte el líquido a la columna. Generalmente las columnas de sílica requieren alta presión para que el flujo de líquido sea adecuado, la mezcladora se requiere para variar la proporción de solvente en la fase móvil y el inyector permite la aplicación de la muestra. A la salida de la columna se coloca un detector generalmente de absorción ultravioleta  o de fluorescencia y si se desea recuperar las moléculas que eluyen de la columna, se requiere un colector.
En los sistemas modernos el análisis de la información obtenida se realizan mediante una computadora acoplada al equipo; lo que permite estandarizar la cromatografía, identificar  la naturaleza los picos eluídos y cuantificar su contenido. Los picos se relacionan según su "tiempo de retención" con estándares, que permiten identificar los aminoácidos presentes en la mezcla. La cantidad relativa de cada uno de ellos se determina calculando el área la curva del pico correspondiente.

1.1.3.5.3.6. Cromatografía de intercambio iónico.
    La Fase Estacionaria  es una resina de intercambio iónico que contiene grupos cargados, teniendo la propiedad de separar especies ionizadas (Cationes o Aniones); la Fase Móvil es generalmente una solución amortiguadora de pH. En proteínas la cromatografía de intercambio iónico se basa en las diferencias en signo y magnitud de la carga eléctrica neta de las proteínas a un valor de pH determinado. La afinidad de cada proteína a los grupos cargados de la columna esta influenciada por el pH y por la concentración de iones en solución (concentración salina) que compiten con la proteína en la interacción con la matriz. La separación de la proteína de la matriz cargada puede obtenerse gradualmente cambiando el pH y/o la concentración salina de la fase móvil, de tal forma que se genere un gradiente de concentración.

1.1.3.5.3.7. Cromatografía por Permeabilidad en Gel.
    Es útil para la separación de proteínas. La Cromatografía de exclusión molecular, también llamada de filtración en gel, separa en función de su tamaño. La matriz de la columna esta formada por un polímero entrecruzado con poros de tamaños determinados. Las proteínas de mayor tamaño migran más deprisa a lo largo de la columna que las de pequeño tamaño, debido a que son demasiado grandes para introducirse en los poros de las bolas de polímero y por tanto siguen una ruta más corta y directa a lo largo de la longitud de la columna. Las proteínas de menor tamaño, entran en los poros y su marcha a lo largo de la columna es más lenta.

1.1.3.5.3.8. Cromatografía de Afinidad.
    La Cromatografía de Afinidad permite la separación de mezclas proteicas por su afinidad o capacidad de unión a un determinado ligando. En este caso, las proteínas que se retienen en la columna son aquellas que se unen específicamente a un ligando que previamente se ha unido covalentemente a la matriz de la columna. Después de que las proteínas que no se unen al ligando son lavadas o eluidas a través de la columna, la proteína de interés que ha quedado retenida en la columna se eluye o libera mediante el empleo de una solución que contiene bien ligando libre u otro compuesto que rompa la interacción entre el ligando y la proteína.


Tipos de cromatografía
 
Naturaleza de fase estacionaria
 
Naturaleza de fase estacionaria
Sólido
Adsorción
Exclusión 
Cambio iónico
Afinidad
Líquido 
Partición 
Naturaleza de fase móvil
Liquido
Líquido-líquido ((partición)
Líquido-sólido)adsorción, cambio iónico, exclusión, Afinidad.
Gas
Gas-líquido (CGL)
Gas-sólido (CGS)
 
Cromatografía de afinidad
        Se trata de un tipo especial de cromatografía de adsorción sólido-líquido en la que la sustancia de naturaleza bioquímica (anticuerpos, cofactores, inhibidores enzimáticos, lectinas y otras moléculas) denominadas ligandos de afinidad y enlazados químicamente en soportes sólidos adecuados, retienen a los solutos (analitos), también de naturaleza bioquímica, de manera reversible y selectiva. Las separaciones se basan en el acoplamiento ¨llave-cerradura¨ típico de la biología molecular.

Fundamento de la cromatografía de afinidad
        En la figura  se muestra de forma esquemática el fundamento de las separaciones mediante cromatografía de afinidad. Un volumen no excesivamente grande de muestra de naturaleza biológica se introduce en la columna que contienen un soporte polimérico inerte que retienen a la sustancia activa enlazado covalentemente y que se denomina ligando de afinidad. Sólo existe interacción específica entre este ligando y un soluto-analito (proteína) de la muestra insertada que queda retenido (adsorbido). Se procede a la elución de los demás componentes de la muestra mediante una primera fase móvil que no influye en el acoplamiento. A continuación se introduce una nueva fase movil que desactiva el acoplamiento por alteración reversible de los sitios activos del inhibidor-ligando, del soluto (proteína) o de ambos; generalmente se utiliza un cambio de pH que modifica las características de los sitios activos; se eluye así el soluto de interés. Una vez finalizada la separación, se procede a la regeneración de la columna, lo que generalmente se hace mediante el empleo de la primera fase móvil y constituye una etapa rápida.
        La cromatografía de afinidad tiene una serie de características generales que la distinguen de otros tipos de cromatografía líquidas

  • Alta selectividad en el mecanismo de retención
  • Campo de aplicación restringido
  • Separación de un solo soluto analito
  • Empleo de sistema de baja presión
  • Columnas cortas de escasa eficacia cromatográfica
  • Ligandos de afinidad
            Son las moléculas bioquímicas que se encuentran ancladas químicamente sobre el soporte sólido inerte, y son las responsables de la adsorción específica de los solutos-analitos. Pueden considerarse dos clasificaciones de los mismos: Según su naturaleza, pueden ser macromoléculas biológicas o bien moleculas de bajo peso molecular de biomoléculas pequeñas o macromoléculas bioquímicas, respectivamente. Y según su actuación. Que se fundamenta en la selectividad en la retención que condiciona las características de la cromatografía de afinidad; se distinguen dos grandes grupos: Ligandos específicos , como los anticuerpos , que se enlazan reversiblemente a un solo soluto, y los ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos bioquímicos, como las lectinas y nucleótidos.


    Esquema de un cromatograma de afinidad.

    Soportes
            El material sobre cuya superficie activada se establece el enlace covalente con el ligando de afinidad. Debe poseer propiedades como tener una gran superficie, tamaño del grano controlable, porosidad controlable, carácter suficientemente hidrofílico para evitar adsorciones no específicas de proteínas u otras moléculas, estabilidad mecánica, en especial para trabajar a alta presión.
            El material utilizado generalmente para el soporte son geles orgánicos derivados de los polisacáridos como la agarosa (sepharosa), polímeros de acrilamida, fractogel TSK y sílices CPG.

    Inmovilización de ligandos
            La inmovilización de los ligandos de afinidad es un proceso complejo que en cada caso tiene connotaciones específicas.
            El general, los ligandos de afinidad se inmovilizan mediante el establecimiento de enlaces químicos covalente con el soporte sólido activado y un grupo reactivo del ligando que esté lo más lejos posible de la zona activa de bioadsorción.
            El objetivo de la inmovilización consiste en obtener una capa estable y densa del ligando bioquímico que conserve su actividad específica con plenitud.
            La inmovización del ligando de afinidad se realiza en general mediante dos etapas secuenciales:
    - Activación del soporte, que consiste en el ataque químico con diferentes reactivos de la superficie de los soportes antes mencionados, que se caracterizan por poseer grupos hidroxilos superficiales. De la gran variedad de procedimientos el más común es el ataque con bromuro de cianógeno sobre la matriz de polisacárido. Según el pito de matriz se originan grupos diferentes: ésteres cianato en agarosa e imidocarbonatos en dextranos, según reacciones uno o dos grupos hidroxilos de la matriz. Esta etapa produce en un disolvente orgánico o en mezclas con agua. Luego sigue el anclaje químico del ligando que se da mediante la reacción de grupos amino del mismo, fundamentalmente con el soporte activado.

    Metodos de elución
            Según la naturaleza de los ligandos de afinidad y la de los solutos-analitos, y teniendo en cuanta la forma de eliminar los solutos de la columna, cave distinguir los procedimientos generales de elución como:
    Elución bioespecífica: La fase móvil desplazante contiene a un modificador (generalmente llamado inhibidor) que en realidad se trata de un ligando de afinidad no ligado de bajo peso molecular que interacciona con el sitio activo de la macromolécula biológica que puede ser soluto-analito o bien el ligando de afinidad para solutos de bajo peso molecular, produciéndose en todos los casos una elución por desplazamiento o competencia entre los componentes de bajo peso molecular ligados o no, con el sitio activo de la macromolécula biológica ligada o libre. Se distinguen 2 tipos de elución bioespecífica la normal y la invertida.
            La elución normal se basa en la interacción inhibidor-analito, que es la situación más frecuente. El analito es una biosustancia macromolecular que es retenida por un ligando de afinidad de bajo peso molecular, y eluida con un inhibidor que es también de bajo peso molecular y que tiene preferencia por el sitio activo del analito, por lo que es retirada del sólido y eluida. Ejemplo, la purificación de la lectina.
            La elución invertida, se basa en la interacción inhibidor-ligando de afinidad. El cual es una biomacromolécula que retienen específicamente el analito. La presencia del inhibidor en la fase móvil provoca un desplazamiento análogo al anterior y se eluye el analito. Se usa lectina para purificar glucoproteína.
            En la elución no bioespecífica, la fase móvil provoca la denaturación del ligando inmovilizado, del soluto-analito o de ambos mediante el cambio suave y reversible de los correspondientes sitios activo, de tal manera que se interrumpe la adsorción bioespecífica mediante eliminación de una o varias de las causas que la provocan.

    NOMENCLATURA IUPAC PARA CROMATOGRAFIA

    TERMINO
    Cromatografía. La cromatografía es un método físico de separación en el que los componentes a separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales está en reposo (fase estacionaria) mientras que la otra (fase móvil) se mueve en una dirección definida.
    Cromatógrafo. El instrumento empleado para realizar una separación cromatográfica.
    Cromatógrama. Una gráfica u otro tipo de presentación de la respuesta de un detector, la concentración de un analito en el efluente u otra magnitud usada como medida de la concentración en el efluente, frente al volumen de efluente o al tiempo. En la cromatografía plana, "cromatógrama" puede referirse al papel o capa con las zonas separadas.
    Fase Ligada. Una fase estacionaria que está unida de forma covalente a las partículas de soporte o a la pared interior de la columna.
    Fase Inmovilizada. Una fase estacionaria que está inmovilizada sobre las partículas del soporte o sobre la pared interior de la columna, por ejemplo por polimerización in situ (entrecruzamiento químico) tras un recubrimiento.
    Fase Móvil. Fluido que se filtra a través o a lo largo del lecho estacionario, en una dirección definida. Puede ser un líquido (Cromatografía Líquida), un gas (Cromatografía de Gases) o un fluido supercrítico (Cromatografía con Fluido Supercrítico). En la cromatografía de gases se uede usar la expresión Gas Portador para la fase móvil. En la cromatografía de elución se usa también para la fase móvil la expresión Eluyente.
    Eluir. Aplicar la cromatografía de elución. El proceso de elución se puede detener mientras todos los componentes de la muestra están aún en el lecho cromatográfico, o continuarse hasta que lo hayan abandonado. Nota: Se prefiere el término "Eluir" a "Desarrollar", término usado en nomenclaturas anteriores de cromatografía plana.
    Efluente. La fase móvil que abandona la columna.
    Muestra. Mezcla consistente en cierto número de componentes, cuya separación se pretende en el lecho cromatográfico al ser arrastrados o eluidos por la fase móvil.
    Componentes de la Muestra. Los constituyentes químicamente puros de la muestra. Pueden no ser retenidos por la fase estacionaria (es decir, no retardados), retenidos parcialmente (es decir, eluidos a tiempos diferentes) o retenidos permanentemente. Se aceptan también los términos Eluito y Analito para un componente de la muestra

    Métodos principales
    Cromatografía Frontal: Procedimiento en el que la muestra (líquida o gaseosa) se alimenta de forma continua al lecho cromatográfico. No se utiliza ninguna fase móvil adicional
    Cromatografía de Desplazamiento: Procedimiento en el cual la fase móvil contiene un compuesto (el desplazarte) que es retenido más fuertemente que los componentes de la muestra analizada. La muestra se alimenta al sistema en forma discreta, como una pequeña cantidad en un intervalo breve.
    Cromatografía de Elusión: Procedimiento en el que la fase móvil se pasa de forma continua a través o a lo largo del lecho cromatográfico y la muestra se suministra al sistema de forma discreta, como una pequeña cantidad en un tiempo breve.

    Clasificación de acuerdo al lecho cromatografico
    Cromatografía en Columna: Técnica de separación en la que el lecho estacionario está contenido dentro de un tubo. Las partículas de fase estacionaria sólida, o de soporte recubierto con una fase estacionaria líquida, pueden llenar por completo el tubo (Columna Empaquetada) o estar concentradas sobre o a lo largo de su pared interna, dejando una ruta abierta, no restringida, para el paso de la fase móvil por el centro del tubo (Columna Tubular Abierta).
    Cromatografía plana: Técnica de separación en la que la fase estacionaria está en forma de plano o sobre un plano. Éste puede ser un papel, que sirva como tal o que esté impregnado con una sustancia que actúe de fase estacionaria (Cromatografía en Papel), o una capa de partículas sólidas extendida sobre un soporte, tal como una placa de vidrio (Cromatografía en Capa Fina, TLC). A veces a la cromatografía plana se la llama también Cromatografía de Lecho Abierto.

    Literatura recomendada
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    Lawrence, A., Kaplan, y Pesce, J. 1986. Quimica clinica: Técnicas de laboratorio, fisiopatologia, métodos de análisis. Teoría, análisis y correlacion. Editorial Medica Panamericana. Junin, Buenos Aires. 1739 p.
    http://www.utoronto.ca/krause/affinity.html (protocolo)
    http://www.sdk.co.jp/shodex/english/dc010801.htm ( columnas)
    http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/affinity (generalidades)
    Murray p. Deutscher. 1990. Methods in enzymology volume 182, Guide To protein Purification. Academic Press. Inc. San Diego California, United States of America. 309-380
    Lehninger  Principles of Biochemistry. (3º Ed.). D.L. Nelson and M.M. Cox. Worth Pub.. New York. (2000). Edición en castellano. Principios de Bioquímica. (2002).
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