1.1.4. Cultivos celulares

    El cultivo celular o cultivo de tejidos, como también se le llama, tiene su origen en el siglo XIX, como un método para el estudio del comportamiento de las células animales libres de las variaciones sistémicas ocurridas dentro del organismo durante su normal homeostasis y bajo el estrés de un experimento. Estas técnicas iniciaron con el cultivo de fragmentos no disgregados de tejidos, los cuales restringían la mitosis de las células cultivadas y por tanto su crecimiento. Después se realizaron cultivos con fragmentos disgregados de tejidos, los cuales aumentaban el crecimiento celular en cultivo ya que se utilizaban células dispersas; esto fue un gran avance y provocó una explosiva expansión en esta área desde los años 50s (Morgan, 1995).

EVOLUCION DE LOS CULTIVOS CELULARES
     El cultivo de células tuvo su origen en el siglo XIX. Rechlinhausen en 1866, mantuvo vivas células sanguíneas de anfibio, pero fue la utilización de bloques de agar con plasma coagulado (soporte y alimento) el inicio del cultivo de células in vitro (Freshney, 1987).
        El desarrollo del cultivo de células de vertebrados se inició con las observaciones de Roux (1885) en cultivos de células de embrión de pollo; posteriormente Harrison (1907) cultivó tejido nervioso de rana el cual más adelante fue reemplazada por plasma de pollo (Burrows, 1910); posteriormente, se aplicó esta técnica para el estudio en animales de sangre caliente (Carrel, 1912).
     Una serie de innovaciones como el desarrollo de medios de cultivo (Eagle, 1955), el uso de antibióticos, las técnicas de tripsinización para el pasaje de células (Moscona y Moscona, 1952) y la suplementación del medio con suero fetal bovino, permitieron el desarrollo y aplicabilidad de los cultivos de células de origen vertebrado.
     El empleo de técnicas de fusión celular (Barski, 1960; Littlefield, 1964) estableció las bases de la genética de células somáticas para el análisis de especies animales (incluyendo al hombre); igualmente la técnica de anticuerpos monoclonales (Kohler y Milstein, 1975) ha permitido estudios en inmunología y su aplicación a nivel terapéutico.

    En la actualidad, pueden cultivarse en el laboratorio células procedentes de una amplia gama de tejidos y organismos diferentes. En un principio, el objetivo principal era el estudio de las propias células, cómo crecen, qué necesitan para su crecimiento, cómo y cuando dejan de crecer. Este tipo de estudios tiene hoy un gran interés científico, por ejemplo, en relación con investigaciones sobre el ciclo celular, el control del crecimiento de células tumorales y la modulación de la expresión genética. Otra área de gran interés se centra en la biología del desarrollo. Los esfuerzos para explicar cómo el gran número de células presentes en organismo maduro derivan de una sola célula a partir de la fertilización han llevado a la búsqueda de modelos experimentales.
       El cultivo celular es muy adecuado como modelo para el estudio del desarrollo y la diferenciación, por lo que las líneas celulares que conservan la capacidad de diferenciarse in vitro son objeto de un intenso estudio. Por último, hay cierto tipo de investigaciones que no pueden realizarse sin el cultivo de células, por ejemplo, el trabajo con animales transgénicos, conduce a que organismos maduros expresen genes nuevos, se basa totalmente en las técnicas de cultivo celular para la inserción de genes extraños en las células receptoras. Así mismo, la tecnología de la fusión celular y los ensayos de citotoxicidad son técnicas de cultivo celular que, en cierto modo, han sido diseñadas para sustituir a la metodología in vivo (Cohen, 1995).

Definición: TECNICA DE CRECIMIENTO DE CÉLULAS in vitro,  QUE PERMITE REPRODUCIR LAS CONDICIONES EXISTENTES in vivo.
 

1.1.4.1.  Biología del cultivo celular

    La validez de un cultivo celular como modelo de función fisiológica in vivo ha sido criticado, ya que se presentan problemas de caracterización por la alteración del desarrollo celular; la proliferación in vitro no se presenta de igual manera a la de in vivo, debido a la reducción de la relación célula-célula y la interacción matriz-célula por la no presencia de la heterogeneidad y la estructura tridimensional de las células hallada in vivo, además porque el medio hormonal y nutricional se ve alterado. Esto crea un ambiente que favorece la difusión, migración y proliferación de células no especializadas, pero no a la expresión de funciones diferenciadas. La provisión de un ambiente apropiado, nutriente, hormonas y sustratos son fundamentales para la expresión de funciones especializadas (Brand, et al., 1997).
    En un cultivo celular la mayoría de las células crecidas a partir de un tejido sólido disgregado o de un subcultivo tienen la capacidad de adherirse en monocapa, transformarse o anclarse independientemente. Esta adherencia celular es mediada por receptores celulares específicos de superficie en la matriz extracelular  y la dispersión celular podría ser precedida por la secreción de proteínas de matriz extracelular y proteoglicanos por parte de la célula. Las células se pueden anclar y difundir en el vidrio donde se cultivan por medio de ligeras cargas negativas y al plástico, como el poliestireno, si tienen una propiedad o tratamiento con descargas eléctricas o con radiación ionizante de alta energía. El cultivo en vidrio o plástico provee condiciones favorables para el crecimiento y anclaje celular (Freshney, 1995).
    El crecimiento de las células en un cultivo celular primario depende de la supervivencia de éstas a las diferentes técnicas de disgregación y a la capacidad de adherirse al sustrato o de sobrevivir en suspensión. Si el cultivo primario es mantenido por pocas horas podría ocurrir un paso de selección futuro. Las células capaces de proliferar podrían aumentar, otros tipos de células podrían sobrevivir pero no aumentar y otras podrían ser capaces de sobrevivir en condiciones especiales. Además el crecimiento celular va ligado al espacio del cultivo, ya que unas células detienen  su crecimiento, mientras que otras lo incrementan (Freshney, 1995).
     Se cultivan células de plantas, animales y humanos en un caldo de cultivo en el laboratorio. Las células de humanos y tejidos se pueden obtener de biopsias, post-mortem, placentas o de procedimientos quirúrgicos. Se pueden cultivar una amplia variedad de cultivos de células, así como células de cáncer y sangre humanas para investigar cómo los virus provocan infecciones; las células de la placenta humana se pueden utilizar para probar si los medicamentos pueden atravesar la placenta, o células de las articulaciones humanas para estudiar medicamentos contra el reuma.
      Los cultivos de células y tejidos pueden ser altamente sensibles a las sustancias químicas y permitir a los investigadores estudiar partes del cuerpo específicamente identificadas. Se han utilizado cultivos de células en investigaciones para el cáncer, el Parkinson, SIDA, desarrollo de medicamentos, toxicidad y Alzheimer.
     Son el producto de la colección de células vegetales o animales de diferentes órganos, colocadas en condiciones especiales propicias para su sobrevivencia y multiplicación, manteniendo para esto todas sus funciones metabólicas de una manera semejante a las que tenía en el huésped.
     Los cultivos de células animales se han clasificado de acuerdo a su capacidad de anclaje (adherencia), y así han sido aisladas recientemente de un órgano determinado o si provienen de células que han sufrido modificación.
    De acuerdo a su capacidad de adherencia o no a una superficie determinada pueden crecer formando monocapa o en suspensión respectivamente, lo que está muy asociado con el tipo de célula de la cual derivan: por lo general las células provenientes de órganos, crecen en monocapa; igualmente existen células que pueden crecer indistintamente tanto en monocapa como en suspensión, ejemplo son las células HeLa que son células transformadas derivadas de cultivos en monocapa.
    Cuando el cultivo proviene de células que han sido disgregadas de un tejido original tomado de un órgano de un animal recién sacrificado, reciben el nombre de Cultivo Primario.
     Cuando éste cultivo primario es sometido a procesos de transformación que le confiere capacidad ilimitada de multiplicación, reciben el nombre de Líneas Celulares.
     Cuando de un cultivo primario genera otro tipo de células que se pueden separar recibe el nombre de Cultivos Secundarios.
     Cuando en el cultivo coexisten dos tipos de células de linajes diferentes que se pueden separar  recibe el nombre de Cocultivo.

1.1.4.2. Tipos de cultivo celular

CULTIVOS EN MONOCAPA
 Las células exhiben una variedad de "comportamientos sociales", permitiendo la formación de una monocapa que cubrirá la correspondiente superficie de crecimiento (confluencia), lo que hace que su multiplicación sea inhibida cuando establecen contacto entre sí (quiescencia).
 Las células provenientes de cultivos primarios son las que mejor crecen en ésta condición, dada su estabilidad genética y su naturaleza diploide normal.
 Los recipientes para el cultivo de células estacionarias son cajas de Petri, frascos para el cultivo de tejido (Roux), entre otros, que pueden ser de material de plástico o de vidrio previamente tratado y su desprendimiento para transferirlas a superficies mayores se realizan con agentes proteolíticos como la tripsina.

CULTIVOS EN SUSPENSION
 Las Líneas celulares que provienen de cultivos primarios con requerimiento de anclaje a superficies, tienen la propiedad de crecer de manera estacionaria o en suspensión después de un período de adaptación
 Existe evidencia experimental que los sistemas en suspensión también requieren de matrices que son macromoléculas, que sirven de protectores a la superficie celular; éstas macromoléculas se encuentran en el suero, el cual contribuye igualmente con el medio de cultivo, proporcionando un sistema balanceado de nutrientes. Dentro de éstas matrices está el Methocel, esencial para el crecimiento de cultivos en suspensión.
 Aunque el cultivo estacionario es ideal cuando se busca la elaboración de productos extracelulares, el cultivo en suspensión es deseable cuando los productos son intracelulares o cuando se presentan problemas con la capacidad de anclaje de un determinado tipo de célula.
 El proceso de cultivo continuo ofrece factores económicos decisivos (utilización de mejores equipos, reducida manipulación) cuando se trata de producir cultivos a una mayor escala de operación.

CULTIVOS PRIMARIOS
Los cultivos primarios tienen características especiales que los diferencian de las líneas celulares: conservan la morfología de las células del órgano del que fueron aisladas, sus cromosomas tienen un número diploide (2n), su crecimiento in vitro es limitado y hay inhibición por contacto.
 El estar más cercanas a las células que las originaron, se ve reflejado en una mejor actividad y funcionalidad similar a su ambiente natural, por lo que en aislamientos primarios de cepas virales éstas tienen mayor sensibilidad que una Línea Celular ya establecida. Igualmente para la producción de vacunas los cultivos primarios son recomendables por tener una baja probabilidad de que se transformen en malignos.
Dentro de las desventajas está la de una mayor probabilidad de presentar virus adventicios o latentes, lo que implica el desarrollo de la adecuada tecnología para el control de calidad.

LINEAS CELULARES
 Las Líneas Celulares continuas están formadas por células que se diferencian genética y morfológicamente de las células de las cuales se originaron. Pueden provenir de células que se derivan de tumores o de un proceso de transformación de un cultivo primario mediante transfección con oncogenes o con tratamiento con carcinogenéticos, lo que les confiere un nuevo fenotipo.
 Este tipo de cultivo tiene la característica de no tener inhibición por contacto y de crecer de manera indefinida. El paso de un cultivo primario a línea se denomina transformación.
 Una transformación puede inducirse fisiológicamente (interacción celular, polaridad) a través de hormonas como la hidrocortizona o utilizando inductores no fisiológicos como el DMS.

CULTIVOS TRIDIMENSIONALES
 Son aquellos que buscan mantener la característica o arquitectura del tejido in vivo. Los sistemas tridimensionales permiten estudiar la proliferación y morfología epitelial y su interacción con otras células como son las del tejido conectivo; igualmente con ellos se puede evaluar el efecto de sustancias que pueden influenciar en tales interacciones intercelulares. Actualmente se producen Kits dérmicos comerciales con base en cultivos, que permiten evaluar la citotoxicidad de componentes químicos presentes en lociones, preservativos, detergentes, perfumes, shampoos y solventes entre otros.
 Los intentos de producción de éste tipo de cultivo van desde el uso de telaraña (Harrison, 1914), pasando por el crecimiento de explantes en esponja de celulosa, (Leighton, 1951), así como la utilización de fibras de sílica (Curtis y Varde, 1964) o de mallas de colágeno hidratado (Elsdale y Bard, 1972).
    El método desarrollado por Bergenholtz (1977) es uno de los que mayor información han dado en cuanto a visualización de morfología celular. Mediante éste sistema, se colocan trocitos de superficie epitelial sobre una membrana de Millipore, sistema que se deposita sobre una plataforma y ésta en una caja de Petri con medio de cultivo.
 El cultivo in vitro de tejidos vegetales ha sido visto como la opción para producir metabolitos secundarios (Balandrín et al., 1985). Sin embargo, con excepción de contados casos, la desdiferenciación de los tejidos vegetales, para producir callos o células en suspensión, se ve acompañada de una disminución en su capacidad para producir estos compuestos (Barz et al., 1977, Aird et al., 1988). No obstante esta dificultad, los cultivos de células y órganos derivados de plantas productoras de metabolitos secundarios son cada vez más utilizados como modelos para estudiar la biosíntesis de compuestos con actividad farmacológica, así como los mecanismos que regulan su síntesis (Kutchan et al., 1991).
    El cultivo de órganos  permite la ampliación de un cultivo de células de tejido no disgregadas a un cultivo tridimensional que muestre en algo o en todo las características histológicas de los tejidos in vivo, para esto se utiliza un medio con interfase líquido gaseosa.

       El cultivo de cortes de tejido el cual utiliza fragmentos de tejidos colocados en vasos de vidrio o plástico con un medio con interfase líquida que va a promover la migración de las células cultivadas hacia un plano sólido provisto de un sustrato específico para cada célula (Freshney, 1995).
    El cultivo de células dispersas en suspensión se refiere al cultivo de células tomadas del tejido original, de cultivos primarios de células o de una línea o cadena celular por disgregación enzimática, mecánica o química, este cultivo necesita de una monocapa adherente o un sustrato sólido que le provea a las células un medio adecuado para desarrollarse.
    Se realiza también el cultivo primario en el cual las células han sido reasociadas para recrear la estructura tridimensional del tejido; esto realizado por perfusión y por el crecimiento de una monocapa, la reagregación en suspensión, o la infiltración de una matriz tridimensional como el colágeno. Derivado del cultivo anterior encontramos el cultivo secundario en el cual se cultivan  diferentes provenientes de una misma, es el caso de los cultivos de astrocitos donde se puede obtener, en un mismo cultivo, crecimiento de los tipos I y II de éstas células.
    En la actualidad se están realizando cultivos que permiten la recombinación de células de diferentes linajes como los queratinocitos de la epidermis en combinación con los fibroblastos de la dermis; a estos cultivos se les denomina cocultivos (Frashney, 1995). Dentro de estos cultivos encontramos  los cultivos de neuronas y astrocitos en conjunto, en los cuales  se ha confirmado el ciclo de la glutamina-glutamato por medio de análisis de los isótopos del glutamato y la glutamina, donde la glutamina es producto de los astrocitos y el glutamato y el aspartato producto de las neuronas. Además, se ha estudiado el acetato en estas células, el cual es metabolizado por ambas células, neuronas y astrocitos (Brand, 1997).
    El cultivo de células transformadas generalmente se obtiene por la inyección de un carcinógeno, después de una serie de cultivos alternados y pasaje por animales (Benda, et al., 1968; McMorris, et al., 1973). Estas líneas celulares son capaces de desempeñar sus funciones órgano específicas generalmente durante el período de un año. La forma de estas células depende en gran parte, de las condiciones del cultivo utilizadas. Las células que crecen en cultivos en suspensión son casi siempre redondas con pocas prolongaciones. Sin embargo, cuando las células de origen cerebral crecen sobre superficies planas muestran una diversidad morfológica notable, con prolongaciones celulares y neuritas, que se forman con facilidad, mientras que los cuerpos celulares adoptan una forma alargada (ATCC, 1992; Benda, et al., 1968).

1.1.4.3. Ventajas del cultivo celular
    Las dos principales ventajas cuando se utilizan los cultivos celulares son: el control del medio fisicoquímico, a saber, pH, temperatura, presión osmótica, tensión de oxígeno (O2) y gas carbónico (CO2) de las células cultivadas y, las condiciones fisiológicas que deben ser constantes. La mayoría de las líneas celulares requieren para su buen desarrollo de suplementos en el medio en que se cultivan, ejemplo de esto es el suero, el cual provee infinidad de elementos como hormonas y otras sustancias reguladoras (Borg, et al., 1985). El control del medio fisicoquímico y de las condiciones fisiológicas permiten el cultivo de células específicas.
    Los cultivos de células permiten someter a las mismas a una baja y definida concentración de reactivos asegurando un acceso directo en ellas, lo que ahorra en un 90% lo requerido para la inyección del reactivo in vivo, su excreción y su posterior distribución a los tejidos en estudio. Aunque los estudios in vivo resulten más económicos  que los in vitro  son descartados porque el uso de la experimentación en animales resulta cuestionado en aspectos legales, morales y éticos (Freshney, 1995).
    Permiten el estudio del transporte y la utilización de metabolitos.

1.1.4.4. Desventajas del cultivo celular

    Las técnicas de cultivo celular necesitan unas estrictas condiciones de asepsia porque las células animales crecen menos rápido que la mayoría de los contaminantes comunes como  las bacterias, los mohos y las levaduras. Además las células precedentes de animales  no pueden desarrollarse en medios de cultivo, por lo que es necesario agregar a los medios  suplementos como suero, plasma y fluidos intersticiales, entre otros para de una manera u otra proveer a las células cultivadas un medio semejante al  in vivo (Freshney, 1995).
       Una mayor limitación en el cultivo de células es el gasto de esfuerzo y materiales para la producción de una pequeña cantidad de células o de tejido. Los costos de producir células en cultivo son diez veces más que el uso de tejido animal, ya que se invierte bastante en ensayos o procedimientos preparativos que pueden ayudar en la estandarización del proceso reduciendo tiempo de manipulación, volúmenes de muestra, tiempos de centrifugación, etc. (Brand, et al., 1997).
    En los cultivos celulares se dificulta relacionar las células cultivadas con las células funcionales ubicadas en el tejido del cual son derivadas, esto por que en la mayoría de los casos presentan propiedades muy diferentes;  para esto es necesario utilizar marcadores de células los cuales van a ser de gran ayuda en el momento de caracterizarlas en  cultivo porque van a garantizar que las células crecidas en cultivo son las mismas que se sembraron y no otras. Además, suelen presentarse problemas de inestabilidad genética cuando se realizan varios pases de  cultivos de células no transformadas, lo que va a originar una gran heterogeneidad en el crecimiento de las células y en su diferenciación (Driscoll, et al., 1993).

Usos de los cultivos celulares
        Para el estudio de células específicas, cómo crecen, qué necesitan para su crecimiento, cómo y cuando dejan de crecer, como es su bioquímica.
     Para investigaciones sobre el ciclo celular, el control del crecimiento de células tumorales y la modulación de la expresión genética.
     Para la búsqueda de modelos experimentales para estudios de la biología del desarrollo y la diferenciación celular.
     Técnicas de cultivo celular para la inserción de genes extraños en las células receptoras (animales transgénicos).
     La tecnología de la fusión celular y los ensayos de citotoxicidad son técnicas de cultivo celular.

SELECCIÓN DE LA ESPECIE
Especie: Ratas albinas Wistar. Exocriadas o endocriadas.
Parametros de control biotico: Tiempo de desarrollo (gestación), sexo y peso. Ejemplo: Neonatos,  1 día de vida postnatal (5.83±0.05 g, n=132).
Parametros de control abiotico:  luz-oscuridad, humedad, temperatura y dieta (ad libitum).

Niveles y normas de seguridad
American Type Culture Collection (ATCC)
http://www.atcc.org/SearchCatalogs/AllCollections.cfm

Nivel 1. No presentan peligros reconocidos cuando se utilizan en condiciones normales.
Nivel 2. Se emplean para materiales de origen primario humano que no se conoce el riesgo de infección o que tienen la posibilidad de que en las muestras contengan VIH, TBC, hepatitis B u otros patógenos.
Nivel 3. Su manejo pueden presentar un riesgo potencial.
Nivel 4. Extremadamente peligrosos.

EN QUE CONSISTE UN LABORATORIO DE CULTIVOS CELULARES
     Un laboratorio de cultivo celular debe contar con una infraestructura básica en la cual se disponga de áreas independientes para llevar a cabo la preparación y esterilización de medios y reactivos, un espacio independiente para el proceso de lavado y preparación de material y un área propiamente destinada al trabajo con cultivos celulares.
     Dentro de la infraestructura física básica se debe contar con sistemas de refrigeración y congelación, incubadoras, centrífugas, balanzas, microscopios y cabinas de flujo laminar.
 Adicionalmente, se debe disponer de un buen suplemento de material plástico y de vidrio y con sistemas de esterilización apropiados para los diferentes tipos de reactivos y material utilizados.
 Desde el punto de vista de los sistemas de esterilización se pueden citar los siguientes:

Calor Húmedo: Mediante el empleo de autoclaves los cuales proporcionan una temperatura de 121oC y una presión de 15 lb. Utilizados para la esterilización de soluciones cuyos componentes no se degradan por éste método, material plástico y de vidrio y equipos de filtración.

Calor Seco: Lo constituye el uso de hornos a temperatura de 200°C por espacio de 3 horas. Es empleado para la esterilización de material de vidrio particularmente.

Filtración: A través del uso de equipos con membrana de nitrocelulosa o acetato de celulosa con poro de 0.22 ó 0.1 mm de diámetro, mediante la aplicación de presión positiva o negativa. Por éste sistema se esterilizan la mayor parte de los medios de cultivo, suero, solución de antibiótico-antimicótico y suplementos.

Contaje celular
 Para la siembra  de las células se deben tener en cuenta los siguientes cálculos:
Porcentaje de viabilidad (%) = Número de células vivas/Número de células totales *100 (>85-90% se siembra).

*Número de células vivas/ml = Células contadas vivas x factor de dilución x 104

*Número de células necesarias = Número de placas x la mitad del volumen de cada placa x células viables (1.350.000 para neuronas).

Nota: Hemocitómetro o cámara de Neubauer, aparato para hacer contajes en el microscopio.
 El papel del suero, especialmente fetal bovino en el establecimiento y mantenimiento de líneas y cultivos celulares, es fundamental; cuando estos se han establecido en medios libres de suero, el crecimiento celular requiere, la suplementación con hormonas y otros factores de crecimiento que están involucrados en transporte de nutrientes, mantenimiento de balance de energía celular, control de síntesis de macromoléculas y factores que estimulan la formación del producto deseado.

Para un experimento de cultivos con antelación se debe tener en cuenta dos aspectos importantes:

PROGRAMACION - TIEMPOS
        Debido a la extensión de un cultivo, en cultivos primarios se debe programar el tiempo de un experimento desde el momento en que se cruzan los animales para obtener el tejido necesario para los experimentos.
PROGRAMACION - TAMAÑO DE MUESTRA
        Los cultivos celulares son realizados con diferentes replicaciones para permitir la conversión de experimentos heterogéneos, cuando se realiza un solo cultivo, en experimentos homogéneos o uniformes, cuando se realizan varios cultivos (replicaciones)  cada uno con muestra y características de cultivos idénticos. Cuando las replicaciones experimentales sean virtualmente idénticas, la necesidad del análisis de varianza como estadística se reduce (Cohen, 1995).

c

Comparación de dos grupos (medias).
Muestras independientes (completamente aleatorizados)
Precisión deseada
Error tipo I (Nivel de confianza) = 0.05 (95%)
Desviación estándar = 0.05
Distancia a la media poblacional = 0.05
Dos colas
Tamaño de muestra = 16

Pérez, A., Rodríguez, N., Gil, J. y  Ramírez, G. [cd-rom]. 2001. Tamaño de la muestra. Programa sistemático para el calculo del tamaño de la muestra y el poder en diseños de investigación. Ver. 1.1. [Bogotá] Unidad de epidemiología clínica y bioestadística. Facultad de Medicina. Pontificia Universidad Javeriana. 1 cd-rom.

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