1.1.1.5. Microscopia de contraste de fases e interferencia de Nomarski.
    Las células vivas se pueden observar con nitidez en un microscopio de contraste de fases o de contraste de fases interferencial. La posibilidad de que algunos componentes de la célula puedan perderse o distorsionarse durante la preparación de las muestras no ha dejado de preocupar a los especialistas en microscopia. La única solución a este problema es examinar las células mientras aún están vivas, sin ningún tipo de fijación ni congelación. Para este propósito son útiles microscopios con sistemas ópticos especiales.
    Cuando la luz pasa a través de una célula viva, la fase de la onda luminosa varía en relación al índice de refracción de la célula: la luz que pasa a través de una zona relativamente gruesa o densa de la célula, como por ejemplo el núcleo, se retrasa y su fase queda desplazada de forma correspondiente respecto a la de la luz que ha pasado a través de una región adyacente de citoplasma, más fina. El microscopio de contraste de fases y el microscopio de contraste de fases interferencial aprovechan los efectos de interferencia que se producen cuando se combinan estos dos grupos de ondas, creando de esta forma una imagen de la estructura celular. Ambos tipos de microscopios ópticos se utilizan habitualmente para visualizar células vivas. Objetivo
    La microscopia de contraste de fases y la del microscopio de interferencia nos dan la posibilidad de observar células vivas y sin ninguna preparación , ya que al realizar otros procedimientos existe la posibilidad de que algunos de sus componentes puedan perderse o distorsionarse por métodos como la fijación, coloración, congelación, y otros, asi, estos instrumentos ópticos ayudan a resolver el problema.

Principio de la microscopia de contraste
    Las células vivas son transparentes a la luz visible, por lo tanto los rayos de luz pasan a través sin sufrir pérdidas en intensidad.

    La luz transmitida a través de las células vivientes, sin embargo, encuentra a su paso, regiones de índices de refracción diferentes, y diferentes grosores y/o densidades, lo que es capaz de alterar su velocidad y su dirección. En la Figura 1 se da la representación esquemática en donde dos regiones adyacentes de una misma célula, A y B, de un diferente grosor, t1 y t2 y con diferentes índices de refracción, n1 y n2, son atravesadas por un rayo luminoso. Las variaciones en grosor e índices de refracción son capaces de producir una diferencia en el curso óptico de la luz transmitida por las dos regiones. En este caso específico, le toma más tiempo pasar a la luz a través de la fracción B, cuyo índice de refracción es mayor (n2) y por lo tanto esta retrasada la onda del rayo en velocidad con respecto al que es capaz de atravesar la porción A, cuyo índice de refracción es más bajo.
    Si la diferencia de los índices de refracción es pequeña, la magnitud del cambio de fase inducido igualmente es muy pequeña y se mide en términos de longitudes de onda (l). Así, en la representación de la Figura 1, el rayo que pasa a través de la parte B se muestra retrasado 1/4 de longitud de onda ( l/4)  y emerge fuera de fase. con respecto a la transmisión que nos muestra la parte A.

Diseño del instrumento óptico
    El sistema óptico del microscopio de contraste de fases difiere del microscopio ordinario (de luz) solamente en la adición de un diafragma anular colocado debajo de la platina para iluminar el objeto con un cono de luz estrecho y una placa de difracción montada en el objetivo, un diagrama representado en la Figura 2, muestra el diseño de un microscopio de contraste de fase y el curso que siguen los rayos que pasan a través de una estructura celular.
    La fase relativa de luz desviada, saldra 1/4 de longitud de onda retrasado, sí es capturada y cambiada con la introducción de un material retrasador de fase, en aquella parte de la placa de difracción que sea cubierta por cualquiera de los dos rayos, aumentando aún más, otro 1/4 de longitud de onda y logrando retrasar en rayo luminoso en total 1/2 longitud de onda, con lo que se logra que este rayo quede totalmente fuera de fase con respecto a la luz no desviada.
    Cuando la diferencia se presenta es por que los índices de refracción son diferentes y el microscopio de contraste de fase transforma estas variaciones  en brillo o intensidad. Las estructuras celulares presentan muchas irregularidades y son objetos ópticamente no homogéneos; así, la luz que "choca" con el objeto se presenta desviada.

  

Contraste de fase oscuro o positivo: cuando los rayos de luz, la desviada y la no desviada tienden a cancelarse creando una interferencia destructiva y hacer que el objeto aparezca mucho más oscuro que los alrededores.

   Contraste de fase brillante o negativo: se presenta cuando retrasamos la luz no desviada y la hacemos 1/4 de longitud de onda menor, lo que hace que salga al tiempo con la luz desviada, que tiene un retraso de 1/4 de longitud de onda, logrando de esta manera que salgan al mismo tiempo y se recombinen para dar brillo, creando una interferencia constructiva; aumentando en esta forma el objeto mientras su contorno permanece con menos intensidad.
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/techniques/phasecontrast/phase.html

Microscopio de interferencia

        La microscopia de interferencia o técnica DIC (Diffential-Interference Contrast) Nomarski, permite la visualización de especímenes mucho más densos gracias a que la imagen proyectada es tridimensional. Los principios ópticos y la operación del DIC, son bien diferentes a los de microscopia de contraste y su operación es compleja.
        Como los cambios de fase producidos por las estructuras celulares son muy pequeños y por lo general de fracciones de longitud de onda, para poder medir este cambio con precisión es necesario separar por completo la luz que se transmite directamente de la desviada por el objeto, tal como lo hace el microscopio de interferencia.

Nomarski differential interference contrast microscopy.
Fundamentalmente, la luz que se emplea en este caso es polarizada (blanca o monocromática), o sea que tiene la propiedad de concentrar los rayos dispersos en uno solo y se adicionan a los lentes objetivos cuatro componentes ópticos: Polarizador, prisma DIC, señalador DIC y un analizador.
        El objeto espécimen que se encuentra en fase toma direcciones diferentes de acuerdo con los valores de grosor e índices de refracción que presente. El prisma (birrefringente) situado sobre la parte posterior del plano focal del objetivo es usado para recombinar las dos ondas en un solo rayo.
        El objeto atravesado por los dos rayos vuelve a otro prisma (Wollaston) que es el que en realidad crea la interferencia (destructiva o constructiva), así el plano polarizado es recapturado por un analizador, que transforma esto en ondas de vibración de la misma longitud y habilita la interferencia; como respuesta a estas dos últimas acciones tenemos que diferentes regiones del objeto estudiado apareceran con más brillo o menos brillo sobre un fondo oscuro.
        Los espacios laterales de las dos ondas se miden en términos de micrómetros y no se exceden en el tamaño de la resolución perceptible al ojo humano, logrando asi que no se presente una doble imagen al observador.
        En esta microscopia incluir el tipo Nomarski (prisma), lo que obtendremos será una apariencia seudo tridimensional del objeto.

Aplicaciones
        Una de las grandes ventajas del microscopio de contraste de fases, del microscopio de contraste de fases interferencial y del microscopio de campo oscuro estriba en que los tres permiten observar las células en acción y estudiar los movimientos implicados en procesos como la mitosis o la migración celular. Puesto que muchos movimientos son demasiado lentos para ser observados a tiempo real, normalmente resulta útil hacer películas o vídeos por el sistema de aceleración de movimiento (microcinematografía). En esto casos, se toman fotografías sucesivas, separadas por breves períodos de tiempo, de modo que cuando la película o video registrados se proyectan a la velocidad normal los acontecimientos aparecen muy acelerados.
         Esta técnica microscópica se usa para medir  índice de refracción y concentración de sólidos de las estructuras celulares utilizando un metodo de refractometría por inmersión, así se sumergen las células en una solución isotónica cuyo índice de refracción puede variarse.
        Esta refractometría se ha empleado para ser medidos en procesos como la división celular y el desarrollo de esporas fungicas. Igualmente es útil para determinar masa seca y espesor de las estructuras celulares.

2. Microscopio de interferencia diferencial de Nomarski

2.1. Fundamento
    La posibilidad de que algunos de los componentes celulares se distorsionen en el momento del corte y preparación, ha conducido a los científicos a crear microscopios con los cuales se pueda observar células vivas sin ningún tipo de fijación ni de congelación; para este propósito se utilizan sistemas ópticos especiales (1).
C    uando la luz pasa a través de una célula viva, la fase de la onda luminosa varía con relación al índice de refracción de la célula; creándose una interferencia, que retrasa la onda luminosa cuando atraviesa una zona relativamente densa; la microscopia de interferencia diferencial de Nomarski, aprovecha estos efectos de interferencia, para crear una imagen de la estructura celular viva, nítida y tridimensional (1).
    Existen en principio tres tipos de microscopios de interferencias: los microscopios de interferencia de longitud desdoblada, los de dos ondas y los de ondas múltiples. Los de una sola onda, generalmente se denominan microscopios de contraste de fases.  Los de dos ondas, son los auténticos microscopios de interferencia. En el  sistema de iluminación, sistemas ópticos diversos, desdoblan el rayo incidente en haces próximos unos del otro en forma variable según lo desee el operador; un segundo sistema óptico, simétrico al primero, pero situado detrás del objetivo, recompone los dos haces haciéndolos interferir para construir la imagen. Los de ondas múltiples, no son utilizados en microscopia biológica sino en metalografía, para medida de la profundidad de las estructuras (3).

2.2. Partes del microscopio de interferencia diferencial de Nomarski
 Los componentes básicos del microscopio de interferencia diferencial de Nomarski son iguales al microscopio óptico, difiriendo en los sistemas que transmiten el rayo de luz incidente  (3); estos son:


2.3. Principio óptico del microscopio de interferencia diferencial de Nomarski
        La microscopia de contraste de interferencia diferencial de Nomarski usa la combinación de un sistema de luz polarizado y dos rayos divididos para crear fases de diferencias en la muestra. Esto provee una imagen tridimensional de la muestra sin los halos que rodean a la célula en las imágenes generadas en los microscopios de fase de contraste (2).
    El principio del sistema es el siguiente: se utiliza luz blanca polarizada por el filtro plano, este rayo de luz monocromático incide en el condensador completamente abierto y el prisma de Nomarski birrefringente que se encuentra dentro de él, genera dos rayos de luz paralelos, uno incide sobre la muestra a analizar y el segundo pasa en forma paralela sobre la muestra.
Ocurre una diferencia de la trayectoria local del rayo que atraviesa el espécimen causado por el índice de refracción y de grosor, creando una fase distorsionada del rayo incidente que se representa por el desplazamiento del mismo; luego estos rayos atraviesan los lentes del objetivo y también al segundo prisma de Nomarski, allí ubicado, en diferentes porciones, debido a la ruta desigual en la trayectoria óptica con la cual inciden en él; se forma una imagen doble de la muestra lateral y longitudinalmente. Al atravesar estos rayos polarizados y aún paralelos, el filtro analizador los transforma a un mismo plano de vibración, es aquí en donde ocurre la onda de interferencia constructiva o destructiva, que es ocasionada por las diferencias en la trayectoria óptica dentro de la muestra y se manifiestan al observarse en la imagen áreas brillantes y opacas o áreas claras u oscuras. En donde no ocurre la interacción entre el par de rayos, se produce un fondo gris uniforme.
     Los espacios laterales de las dos ondas se miden en términos de micrómetros y no se exceden en el tamaño de la resolución perceptible al ojo humano, logrando así que no se presente una doble imagen al observador, sino una apariencia seudo-tridimensional del objeto estudiado sobre un fondo uniforme.

2.4. Utilidades del microscopio de interferencia diferencial de Nomarski
 El uso de este microscopio hace posible determinar el índice de refracción, la concentración de sólidos, la masa seca y el espesor de las estructuras celulares y estos
cambios han sido estudiados en los procesos como la mitosis o la migración celular; unido a  un método de refractometría por inmersión4.

2.5. Ventajas

2.6. Desventajas

3. Bibliografía
1. Alberts, A., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K y Watson, J. 1994. Biología molecular de la célula. Ediciones Omega. Barcelona, España. Pg.153-154.
2. Gerhardt, P. 1994. Methods for general and molecular bacteriology. American Society for Microbiology. Washington, D. C. USA. Pp. 14-18
3. Locquin, M y Langeron, M. 1985. Manual de Microscopia. Editorial Labor. Barcelona, España. Pg. 42-45.
4. Wilson, G y Morrison, J. 1991. Citología. CECSA. México, D. F. México. Pg. 296.307.

Bibliografía recomendada
Alberts, A. 1996. La célula. Ediciones Omega, Barcelona, España. pg. 155.
Celis, J. 1994. Cell biology.  A laboratory hanbook. Academic press, Inc.  2: 5-15.
Gerhardt, P., et al. 1994. Methods for general and molecular bacteriology.  American Society for Microbiology. Washington, D.C., USA. pp. 14-18.
Wilson, G. y Morrison, J. 1991. Citología. CECSA. Mexico, D.F., México. pg. 296-307.
 

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