1.1.2.2. Microscopia electronica de barrido
     En el microscopio electrónico de barrido, un campo magnetico permite enfocar los rayos catódicos (electrones) y obtener una imagen tridimensional, por el examen de la superficie de las estructuras, permitiendo la observación y la caracterización de materiales orgánicos e inorgánicos, proporciona aumentos de 200.000 diámetros.
        Von Ardenne, en 1.938, construyó el primer Microscopio Electrónico de Barrido (MEB); posteriormente, en Inglaterra, se construyó el primer MEB Ambiental, con el cual se pueden observar muestras hidratadas.

Descripción del Equipo
El MEB consta de las siguientes partes:
1. Cañón de electrones (e-).
2. Filamento de tungsteno o de hexaboruro de lantano-LaB6.
3. Anodo.
4. Columna en vacío.
5. Lentes condensadores (centran y dirigen el rayo de electrones).
6. Lentes Objetivas (controlan la cantidad de electrones del haz).
7. Detectores para colectar y medir electrones (producción de imagen).
8. Bobinas de barrido (obligan al haz a barrer la muestra).
9. Control de aumento.
10. Generador de barrido.
11. Colector de electrones (electrones  se atraen y se aceleran).
12. Escintilador (convierte la energía cinetica de los e- en luz visible).
13. Amplificador.
14. Pantalla (imagen).
15. Bombas de vacío.

Diagrama de funcionamiento
        La muestra es colocada en un pequeño espacio, al cual se le hace vacío después de cerrada la puerta. La puerta tiene tres palancas que el operador usa para: subir y bajar la muestra, rotar la muestra y acercarla o alejarla.
        Un haz delgado de electrones, es producido en la parte superior del microscopio por medio del calentamiento de un filamento metálico (10-30 KV). El rayo de electrones primarios sigue un recorrido a traves de la columna de vacío del microscopio, esto, con el propósito, de evitar la dispersión de los electrones. El trayecto del haz de electrones es enseguida modificado por un conjunto de bobinas deflectoras que lo hacen recorrer la muestra punto por punto y a lo largo de líneas paralelas (barrido), y a su vez atraviesa las lentes condensadoras o electromagneticas que le permiten ser reenfocado o centrado hacia la muestra. Posteriormente, el diámetro del haz de electrones puede ser modificado al pasar por las lentes objetivas que controlan la cantidad de electrones dentro de este. Cuando los electrones primarios golpean la muestra, son emitidos electrones secundarios por el propio especimen.  Estos electrones secundarios son atraídos por un colector donde se aceleran y se dirigen al escintilador, donde la energía cinetica Es convertida en puntos de mayor o de menor luminosidad, es decir, en luz visible. Esta luz es dirigida a un amplificador donde se convierte en senal electrica, la cual pasa a una pantalla de observación donde la imagen  es formada línea por línea y punto por punto. Los circuitos que dirigen las bobinas de barrido (que obligan al haz a barrer la muestra), son las mismas que dirigen la parte de colección de electrones y que producirán la imagen.

Resolución del Equipo
        El MEB tiene una resolución de 10 nm y una profundidad de foco de 10 mm, mucho menor que el microscopio electrónico de transmisión. La ventaja del MEB es que proporciona imágenes tridimensionales, ya que éste específicamente examina la superficie de las esructuras.

Preparación de las muestras
        Se debe tener en cuenta el material a observar y guiarse por parámetros específicos para cada muestra. Los siguientes pasos son utilizados en general  y guían acerca de lo necesario en cada uno.

Limpieza
Reactivo: solución salina
Objetivo: Remoción de contaminantes de la muestra
Comentarios: En muestras como dientes y huesos es necesario limpiar la muestra con una bomba de aire. Para epitielio intestinal se utilizan enzimas (quimiotripsina) que degradan el moco intestinal. En esperma de mamíferos es necesario lavar con solución salina y posteriormente centrifugar suavemente.

Relajación
Reactivo: Cloruro de magnesio, cloretano, hidrato de cloral y anestésicos locales como lidocaína.
Objetivo: Permitir que organismos marinos o de agua fresca, que utilizan el encogimiento y extensión para movilizarse, no se contraigan y pueda observarse toda la superficie de éste.
Comentarios: Se aplica gradualmente hasta que cese el movimiento del organismo.

Fijación
Reactivo: Glutaraldehído, formaldehído, permanganato y acroleína.
Objetivos: Permitir que cese la actividad biológica de la célula y preservar la estructura celular. Mantener la integridad de la superficie. Evitar cambios autolíticos, debido a que al haber remoción del organismo se presnetan cambios en temperatura, pH y concentración de oxígeno y nutrientes.
Comentarios: Se puede utilizar vapor de osmio, específicamente cuando se observan esporas de hongos. Es importante tener en cuenta la concentración del fijador y de la muestra, debido a que diversos estudios muestran que a una mayor concentración de éste, se dificulta la observación de lamuestra.

Deshidratación
Reactivo: Etanol o acetona.
Objetivo: Remover agua de los tejidos
Comentarios: Se utiliza más comúnmente etanol, debido a que la acetona, puede danar el secador en el SPC.

Secado de punto crítico
Reactivo: CO2 líquido y gaseoso.
Objetivo:  Remoción total del agua de la muestra
Comentarios: Este paso se basa en lo siguiente: el CO2 a temperatura baja es líquido y a temperatura alta es gaseoso. Cuando la muestra sale deshidratada por el etanol, se coloca en el secador de punto crítico (SPC), allí, la muestra se purga con CO2 líquido hasta que el etanol haya sido reemplazado, posteriormente se sella la cámara y se calienta hasta que la temperatura llegue a 31ºC, de esta forma el CO2 líquido se evapora y la muestra queda totalmente seca. Este procedimiento reduce de tamano la muestra.

Montaje de la muestra
Objetivo Utilizado: Porta muestra o stub
Objetivo: Colocar la muestra asegurada para permitir la colocación en el rociador de oro.
Comentarios: Para asegurar la muestra en el stub, se utiliza una cinta doble faz (tejidos) o carbono cemento conductivo CCC (dientes).

Recubrimiento con oro (sputter)
Elementos:  Oro, paladio o carbono
Objetivo: Permitir que el haz de electrones primarios choquen contra la muestra recubierta con un material conductor para que estas sean eléctricamente conductivas.
Comentarios: Este pocedimiento se realiza con un rociador o Sputter coater. Se coloca la muestra en la cámara, se sella y se programa el tiempo de recubrimientoen el cual el oro cae uniformemente, se hace vacío y automáticamente el timer se enciende y la muestra se recubre totalmente según el tiempo programado, aproximadamente son 2 minutos. Cuando el tiempo ha finalizado, lentamente empieza a ingresar aire a la cámara y de esta forma, la muestra está lista para colocarla en el MEB. El stub con la muestra recubierta no se debe tocar  con los dedos, por lo tanto es necesario utilizar pinzas.

Almacenamiento
Objeto utilizado: Cámara libre de humedad
Objetivo: Mantener la muestra totalmente seca para posterior observación.

Aplicaciones


Ventajas y Desventajas


Literatura recomendada
1- Dykstra, M. 1992. Biological electron microscopy: theory, techniques and troubleshooting. Plenum Press.
2- Hayat, M.  1981. Fixation for electron microscopy, Academic Press,

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