1.1.2. Microscopia electrónica

1.1.2.1. Microscopia electrónica de transmisión

Introducción.
   El microscopio electrónico no es mas que uno de los muchos aparatos cuyo fundamento es la óptica electrónica. El nombre que resulta justificado por la estrecha analogía existente entre su formulación teórica y la de la óptica clásica. No hay posibilidad de estudiar la óptica electrónica sin enfrentarse con una de las consecuencias aparentemente paradójicas de la física teórica moderna: la dualidad onda-corpúsculo, cuando los electrones inciden como paquetes de ondas sobre los átomos de una muestra, las colisiones pueden representarse, y a veces con gran precisión  como colisiones del tipo bola de billar. Sin embargo, Si la muestra contiene un cristal en una cierta orientación, los electrones deberán representarse por ondas para dar cuenta de las reflexiones.
    La prueba crucial para demostrar la existencia  de las propiedades ondulatorias de los electrones fue la observación de la difracción y de la interferencia de las ondas de los electrones.

 
     Al final del siglo se habían reunido muchos datos sobre la emisión de la luz por los átomos de un gas al ser excitados por una descarga eléctrica. Observada a traves de un espectroscopio con una abertura en forma de rendija estrecha. Las bandas formadas obedecen a las diferentes longitudes de onda que conforman el espectro luminoso. En similar forma y utilizando el espaciado conocido de los átomos de un cristal se calculo la longitud de onda que podía producir dicho máximo y se encontró la correspondencia con la energía de los electrones que eran utilizados. El electrón había adquirido un comportamiento ondulatorio.
     Este comportamiento de onda puede ser tratada en igual forma que el tratamiento hecho sobre la luz por medio de una lente de vidrio. En contra posición, el vidrio no actuaría de igual forma sobre la onda de electrones, era necesario utilizar otro tipo de lente (las magnéticas).
 Los electrones procedentes de un filamento caliente se ven acelerados por una gran diferencia de tensión en el tubo. El haz de electrones se hace paralelo mediante  lentes de enfoque  magnético. los electrones inciden sobre un blanco muy delgado y luego se enfocan mediante una segunda lente magnética que es equivalente a la lente objetivo de un microscopio ordinario. La tercera lente magnética juega el papel del ocular de un microscopio. Proyecta el haz de electrones sobre una pantalla fluorescente donde se realiza la observación de la imagen.

1.   Breve Historia.
         Las ideas  que llevaron a la puesta a punto del microscopio electrónico de alta resolución tuvieron su origen en muy diversos estudios, el descubrimiento del electrón como partícula cargada con masa en reposo; los haces de estas partículas se pueden desviar y concentrar mediante campos  eléctricos y magnéticos  con este principio  se construyo el primer oscilógrafo y dio pie para que  Luis de Broglie  en 1924 lanzara su extraordinaria hipótesis según la cual había de asociar una naturaleza ondulatoria a cada partícula material, Y en particular a los electrones. Dedujo la formula  para la logitud de onda de dichas ondas materiales donde   es la constante de Planck, la masa de la partícula y  su velocidad. Si se sustituyen valores de esta ecuación para un electrón acelerado por un potencial de 60.000 voltios, resulta una longitud de onda de solo 0,05 Å, lo que representa 1/100.000 de la luz visible. Poco después, en 1926, E. Schrôdinger comenzo el desarrollo de la mecánica ondulatoria haciendo uso de las analogías   mecánico-ópticas demostradas por W.R. Hamilton en 1830, y combinándolas con las ideas de De Broglie.  En 1927 La hipótesis de De Broglie fue confirmada experimentalmente con haces electrónicos por Davisson  y Germer en los Estados Unidos y por Thomson y Reid en Inglaterra.
    Los primeros en desarrollar el microscopio electrónico fueron Ersr Ruska y Max Knoll, hacia la década de 1930 (Bozzula y Bartlerr, 1997).
    Con el desarrollo del microscopio electrónico se llegó al territorio celular desconocido hasta el nivel del nanometro, pero el escaso poder de penetración del haz de electrones hizo necesario el desarrollo de técnicas que dejaran las muestras a examinar de extraordinaria finura (una millonésima de centímetro) y su examen debe realizarse bajo intenso vacío. Además de la construcción de instrumentos necesarios para reducir las muestras a cortes ultra finos (Duve, 1988).
    El primer microscopio electrónico fue usado por ingenieros y físicos. El uso del microscopio en el campo de la Biología, fue en sus inicios para estudios puramente descriptivos, pero con el tiempo se ha usado en estudios experimentales. Para el desarrollo y origen de la Biología Celular fue determinante la aparición del microscopio electrónico. Actualmente su uso es multidisciplinario (Bozzula y Bartlerr, 1997). En 1926 después de 15 años de estudio sobre la trayectoria de los electrones en campos magnéticos, H. Busch publico un articulo en el que mostraba que un campo eléctrico o magnético con simetría axial era capaz de actuar como una lente para los electrones u otras partículas cargadas. El trabajo de Busch atrajo la atención de los físicos del momento hacia una consecuencia práctica importante de las teorías de De Broglie y Schrôdinger, y dio origen  a una nueva ciencia de instrumentación que se conoce desde entonces como óptica electrónica, ciencia que busco el desarrollo de la microscopia electrónica ( Electron Microscopy, EM).

2.   Contextualización y funcionamiento  del  microscopio electrónico de transmisión.
     En el campo de la ciencia física moderna es primordial   entender el comportamiento  tanto del haz  de luz como el de electrones, todas las aplicaciones ópticas en cuanto a capturas y ampliación de imágenes que usan este principio prestan gran utilidad para el desarrollo de las ciencias que incursionan en el microcosmos.. Son diversas las técnicas que cumplen con estos propósitos, entre ellas, son dignas de ser citadas las siguientes:
2.1   Microscopia Confocal y de fluorescencia: propia para la observación de imágenes topográficas con carácter tridimensional de sus  estructuras en diferentes tipos de muestras.
2.2   Microscopia electrónica de Barrido y micro análisis de rayos X: Explora las superficies de las muestras realizando un paneo sobre la misma y capturando la radiación reflejada la cual se codifica en datos computacionales con la idea de reconstruir la imagen del espécimen.
2.3   Microscopia electrónica de Fuerza Atómica: Una aguja de punta muy fina casi a nivel atómico explora la superficie de la muestra generando entre ambas un campo electro-magnético. El campo sufre variaciones correspondientes a las variaciones de rugosidad de la superficie muestreada. Las variaciones electromagnéticas ocasionadas generan una información de corriente eléctrica que debidamente tratada reconstruye la imagen de la superficie observada.
2.4    Microscopia electrónica de Efecto Tunel: Conserva el mismo principio que el microscopio de fuerza atómica salvo que la intensidad del campo es mayor y realiza exploraciones bajo la superficie.
2.5   Microscopia electrónica de transmisión: A diferencia de los anteriores microscopios, este no explora superficies , por el contrario el haz de electrones incidente atraviesa la muestra o espécimen  observado y la sombra de detalles finos o ultra-estructura es capturada en una pantalla fosforescente  con propiedades de emisión de luz, ubicada en la parte inferior de la columna. El tener una adecuada preparación de la muestra da lugar a una excelente definición de imagen.  Son múltiples las facetas el las que interviene este tipo de microscopio. Así, en control de calidad señalamientos morfológicos, conformación de agregados, técnicas forenses, determinación de estratos en restauración y diferenciación histológica entre otros.
        En la construcción de microscopios electrónicos (1), se han usado con resultados satisfactorios ambos tipos de lentes: electrostáticas y magnéticas. Con todo, la mayor parte de los microscopios electrónicos hoy día en uso son magnéticos;  Un esquema clásico de estos aparatos esta representado en la figura 2. Algunos  instrumentos no poseen lente condensadora, otros en cambio tienen dos,  mientras otro grupo de aparatos  posee solamente una lente proyectora. Aunque los detalles de construcción varíen  de un tipo a otro, se puede obtener una visión cualitativa de conjunto de sistema óptico.
    La fuente de electrones (2)esta constituida por un hilo  de volframio en forma de horquilla, rodeado por una pantalla cilíndrica polarizada negativamente respecto al filamento( figura 3). Después de atravesar el ánodo conectado a tierra, la mayor parte de los electrones del haz  se  pierden  en las paredes y aberturas excepto un estrecho cono que atraviesa  el diafragma del condensador.
     La lente condensadora se usa tanto para controlar la intensidad luminosa, como para variar la abertura de iluminación relativa en el objeto. Los diámetros de los diafragmas del condensador varían según el tipo de instrumento, pero suelen estar comprendidos entre 0,1 y 0,5 mm. Después de atravesar el objeto, donde muchos electrones se esparcen, el haz penetra en el campo de la lente objetivo que produce una imagen aumentada del objeto. En el objetivo se suele colocar un diafragma de 10 a 100 µ de diámetro para interceptar los electrones esparcidos , pero generalmente esta precaución se omite en el estudio de muestras muy delgadas  en las que el esparcimiento no es excesivo. Puesto que para las distancias usuales entre lente e imagen, el aumento obtenido con la lente objetivo es del orden de X100 a X300, sera necesario el uso de una o mas lentes  protectoras  que vuelvan a aumentar la imagen primaria.  Algunos instrumentos llevan incorporada una pantalla intermedia para facilitar la alineación, pero no poseen en cambio este  accesorio  aquellos aparatos dotados de dos lentes proyectoras. La imagen final se observa en una pantalla fluorescente , y separando esta pantalla del camino del haz, se impresiona una placa fotográfica con dicha imagen. Las dimensiones mas usuales para un microscopio de transmisión pueden ser: Del filamento a la lente condensadora 15 cm, y otro tanto de esta  última al objeto, mientras que del objetivo a la pantalla que recoge la imagen final pueden haber unos 100 cm, el sistema completo deberá ser rígido y capaz de alcanzar un vacío de  0.0001 mmHg con ayudas de bombas de difusión rápidas en serie con bombas rotatorias.
     Otras  partes importantes  importantes del aparato que no han sido representadas en los diagramas son la fuente de alimentación para crear un potencial del haz, fuentes  de alimentación para las lentes  magnéticas , medidores de vacío, tornillos de alineación, válvulas de vacío , controles de aumento y enfoque, etc. De momento,  nuestro interés  mas inmediato se centra en la técnica de preparación de muestras.

Comparación entre microscopia electrónica de transmisión (MET) y microscopia electrónica de barrido (MEB).

Preparación de las muestras
        El proceso comienza con el tejido altamente hidratado y termina con el tejido virtualmente libre de agua y preservado en una matriz de resina.
   Existen muchos caminos para la preparación de tejidos para Microcopia electrónica de transmisión, pero los métodos siguen básicamente ocho pasos:

1. Fijación primaria: Busca preservar la estructura del tejido vivo, evitando los procesos autoliticos. Se realiza con glutaraldehido CHO- CH2-CH2-CH2-CHO. Su acción se centra en las proteínas así:

(COOH-proteína-NH2)2 + CHO- CH2-CH2-CH2-CHO
Entonces:
COOH-proteína-NH=CH-CH2-CH2-CH2-CH=N-proteina-COOH +H2O
    La penetración del glutaraldehido es lenta, esto quiere decir que 1 mm de tejido es atravesado en una hora por el glutaraldehido.

2. Lavado: Normalmente se hace con un buffer.
    Buffer: es necesario su uso debido a que el pH de los tejidos se baja drásticamente durante el proceso de fijación. El uso de buffer mantiene el pH fisiológico (7,2 a 7,4) los sistemas de buffer más comunes son: fosfato, s-collidine, tris-maleato y cacodylate.

3. Fijación secundaria: es llevada a cabo por la acción del tetróxido de osmio, el cual reacciona principalmente con los lípidos. El tetróxido de osmio generalmente no penetra mas de 0,5 mm en una hora.

4. Deshidratación: La filosofía de la deshidratación es el reemplazo del agua usando etanol en series 70% 85% 95% y etanol absoluto.

5. Infiltración con solventes transicionales: procedimiento por el cual hay transmisión de fluidos gradualmente reemplazado por soluciones intermediarias altamente miscibles con los agentes deshidratantes, la mayoría de los protocolos emplean un solvente transicional entre el deshidratante y la resina.

6. Infiltración con resina: mezclas de propilen oxidado con Epoxy son introducidas reemplazando dentro de los tejidos después de la deshidratación. La concentración del solvente es minimizada gradualmente incrementando las concentraciones de resina hasta llegar a la resina pura.

7. Inclusión: sumergir el tejido en la resina pura.

8. Polimerización de la resina: se logra acelerar el proceso de polimerización aumentando la temperatura.

Recipientes de uso común para la inclusión de las muestras en MET. Normalmente las muestras se marcan con un trozo de papel indicando algún tipo de convención que ilustre posteriormente su contenido.

Los tejidos debidamente incluidos son cortados con el ultramicrotomo, dependiendo del tipo de microtomo utiliza cuchillas de diamante o vidrio (la más común). Procesador automático de tejidos.

3.   Técnicas  y aplicaciones
     La novedad(1) de las condiciones requeridas para la formación de la imagen opto-electrónica, comparada con la rutina establecida con los microscopios ópticos  radica en las dificultades  inherentes  de la formación de  una imagen  por electrones , los posibles efectos destructivos de la desecación en vacío, y la búsqueda de contrastes en la imagen hacen cada vez mas difícil esta tarea.
     Las suspensiones purificadas son contrastadas utilizando la técnica de tinción negativa. Para esto, una gota de la suspensión se coloca sobre papel parafinado (Parafilm ) y luego una rejilla de níquel, previamente recubierta con una película de FomvarÒ se deja flotar sobre la gota durante cinco minutos. El exceso de líquido se  retira colocando papel de filtro en los bordes.
    Posteriormente se realiza la tinción negativa con una solución de fosfotungstato de potasio al 2% y pH 6,8. Para ello se coloca una gota del contrastante sobre el papel parafinado y luego la rejilla con la muestra se deja flotar sobre ella durante cinco minutos. Las rejillas se observan en un microscopio electrónico de transmisión. Para la observación del botonamiento de partículas virales, se emplea: una caja de plaqueo, a partir de la cual una porción de agar, localizada sobre una placa en la monocapa de células, se retira y fija con glutaraldehido al 2% en buffer fosfato pH 7,4 y posfija. Después del proceso de deshidratación en concentraciones ascendentes de etanol, las muestras se incluyen en resina LR-White . Se realizan cortes ultrafinos de 40 nm. que son contrastados con acetato de uranilo y citrato de plomo para su posterior observación en el microscopio electrónico de transmisión.

4.   Ventajas  y desventajas.
•Los elevados costos de los equipos  y la debida adecuación de una infraestructura para el buen funcionamiento hacen que esta  técnica , se convierten en acceso de investigadores privilegiados . Si embargo, es común contratar estos servicios por horas o por fotografías  requeridas.
•Los costos de reactivos también dan  un factor decisivo  para la elección de esta técnica. Aun cuando este  proceso de investigación sea costoso , proporciona resultados muy precisos de amplia resolución y magnificación.
•La técnica de preparación de las muestras  cumple con protocolos establecidos, pero son vulnerables  y variados al tipo  de investigación que se realice ,contando mas con la experiencia del investigador.
•La complejidad de los equipos , lo hacen susceptibles  a la des calibración. Nuevamente encontrar las condiciones óptimas requiere de un proceso tedioso y prolongado.
•La manipulación de reactivos se  torna peligroso por la elevada condición toxica de los mismos.
•Las imágenes obtenidas son moncromáticas y planas siendo necesario, en algunos casos, un tratamiento posterior mediante análisis de imágenes con un software especializado.


   El microscopio electrónico de transmisión proyecta electrones a través de una muestra muy delgada de tejido para producir una imagen bidimencional en una pantalla fosforescente. La nitidez de un área particular de la imagen es proporcional al número de electrones que son transmitidos a través de la muestra (Bozzula y Bartlerr, 1997).http://www.luton.ac.uk/Healthcare/Ross/MITOCHON.HTM

    This famous first electron micrograph of an intact cell was published in The Journal of Experimental Medicine in March 1945, in "A study of tissue culture cells by electron microscopy," by Keith R. Porter, Albert Claude, and Ernest F. Fullam. The cell is a cultured fibroblast originating from a chick embryo, which was grown by Porter on polyvinyl film, then peeled off and transferred to a wire specimen grid. The cell was fixed with osmium tetroxide, washed and then dried in order to prevent evaporation in the electron microscopeUs vacuum chamber. Magnified 1600 times, this first electron micrograph of a cell reveals mitochondria, the Golgi apparatus and a "lace-like reticulum" which Porter later named the "endoplasmic reticulum". The electron microsope used for this historic image was an RCA EMB model, operated by Fullam at the Interchemical Corporation in New York City.http://www.rockefeller.edu/rucal/journey/journey.html
 


Literatura recomendada
Duve Christin, 1988. La célula viva.  Editorial Labor. Madrid, España. pg. 11.
Bozzula and Bartlerr. 1997. Electron microscopy.  Principles and tecniques for biologists.  Jones and Bartlett Publishers. London, UK. pp. 2- 36.
1. Cecil, E. 1970. Microscopia Electrónica. Editorial Ediciones Urmo. Mc Graw- Hill Barcelona,España pg 23-55,203-266,315-370.
2. Lopez, J. 1972. Fundamentos de la Ciencia y Técnicas del Vacío. de. Aguilar. /Impreso Madrid España. Pg 92-109.
3. Tipler. P. 2000. Física ,Quinta  Ed. Editorial Reverte /Imprenta Barcelona España.pg 1061-1093, 1101-1163.
4. http://emc.brol.sc.edu/
5. http://www.uq.02.av/nanoworld/nanohome.html
6. http://www.amc.anl.gov/
7.Anderson, R., Mascorro, J. ,Anderson , D. 2002 Diseño por microscopia en instrumentación analítica Volumen (10) numero 6.
8.Matthias, R., Matthias,  G. , Schemmel, A.  1998. La estabilidad mecánica de la microscopia electrónica Biophisical journal. Volumen (75) pg 3008-3014.

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