1. Microscopio de campo claro

1.1. Introducción
    El microscopio es un instrumento básico para el estudio de la Biología, ya que nos permite percibir detalles de organismos y estructuras que no podrían ser observados directamente, por simple inspección ocular (5).
    Para observar elementos tan pequeños es necesario disponer de lentes de aumento. Estas lentes se conocen desde tiempos de Arquímedes, pero la óptica como disciplina se comenzó a desarrollar en el siglo XIII con el monje franciscano Roger Bacon (6).
La utilidad de cualquier tipo de microscopio, no sólo depende de su capacidad de aumento sino, más importante, de su capacidad para resolver detalles (1).
P    ara el estudio del material biológico se dispone de varios tipos de microscopios, lo cuales se pueden clasificar básicamente de acuerdo al tipo de fuente luminosa que usan, siendo el microscopio óptico de campo claro,  el de uso más generalizado (4).
Este es un microscopio compuesto que utiliza dos sistemas de lentes; el primero produce una imagen amplificada del objeto, y el segundo agranda la imagen formada por el primero (5).

De acuerdo con la radiación que utilizan, se clasifican en:
• Ópticos o luminosos:
     - Campo claro
     - Campo oscuro
     - Contraste de fases
     - Fluorescencia
     - Ultravioleta
• Electrónicos
    - Barrido
    - Transmisión

1.2. Microscopio de campo claro.
   Para formar una imagen a partir de un corte histológico usa luz visible, por esto la muestra debe ser lo bastante fina como para que los haces de luz puedan atravesarla. También se usan métodos de tinción, según las necesidades, con el fin de aumentar los detalles en la imagen (3).
    El campo del microscopio está intensamente iluminado, mientras que los objetos observados aparecen más oscuros. En general con este microscopio se pueden alcanzar los 1000 aumentos, pudiéndose llegar con ciertas modificaciones a 2000 y 3000 aumentos (5).
    El ojo humano no logra distinguir objetos de menos de 50 micras de diámetro ni consigue resolver dos líneas separadas por menos de 100 micras (es decir, las ve como una sola línea) Fig 1 (6).

1.3. Curso de la luz en el microscopio
    El condensador proyecta un cono de luz sobre las células que están siendo examinadas en el microscopio. Después de atravesar a las células, ese haz luminoso, en forma de cono, penetra en el objetivo; el objetivo proyecta una imagen aumentada en el plano focal del ocular, que nuevamente la amplia. Por fin la imagen provista por el ocular puede ser percibida por la retina del ojo como una imagen situada a 25 cm de la lente ocular. La ampliación total dada por un microscopio es igual al aumento del objetivo multiplicado por el aumento del ocular (1).

Figura 1. Mecanismo óptico del microscopio de campo blanco. El lente que se encuentra mas cercano al espécimen se denomina objetivo, tiene una distancia focal corta y, forma una imagen real y aumentada que es el objeto del segundo sistema de lentes denominado ocular . El condensador tiene la función de condensar la luz sobre el espécimen (6).

1.4. Sistema mecánico
    Este sistema sostiene al sistema óptico y aloja los elementos necesarios para la iluminación y enfoque del preparado. (6).
  
- Pie: brinda apoyo y estabilidad al aparato (6).
  - Vástago: soporta la platina, tubo y tornillos de ajuste macro y micrométrico (6).
- Tornillo de Ajuste: provocan el desplazamiento del tubo o la platina en sentido vertical, lo que permite el enfoque (6).

   
Pie y Tornillo de ajuste - Tubo: en su extremo superior se halla el ocular, y en el inferior el objetivo. Se trata de un cilindro metálico cuyo interior se encuentra pintado de negro, lo que evita la reflexión de la luz. Normalmente tiene una longitud de 170 mm (6).
-  Platina: es una plataforma horizontal sobre la cual se coloca y sujeta el preparado a observar, tiene un orificio central que permite el paso de la luz y un venier que posibilita la relocalización de los detalles de interés. (6)       Platina -  Subplatina: sostiene al condensador y se ubica por debajo de la platina (6).
 

1.5. Sistema óptico
Se compone de un sistema óptico de observación y un sistema óptico de iluminación; los cuales constan de:
1.5.1. Sistema óptico de observación
- Objetivo: está formado por un sistema de pequeñas lentes ubicadas muy cercanas una de la otra, la que se halla en el extremo distal del objetivo se denomina lente frontal. Los objetivos pueden ser objetivos a seco (no hay ninguna sustancia interpuesta entre la lente frontal y el preparado), u objetivos de inmersión (entre la lente frontal y el preparado se coloca una sustancia cuyo índice de refracción es muy similar al del vidrio) (6).
 
- Ocular: es un tubo cilíndrico con un diafragma fijo en el centro y una lente en cada extremo, la superior se denomina lente ocular y la inferior lente colectora (6).

  Objetivo Y Ocular

1.5.2. Sistema óptico de iluminación
- Condensador: concentra el haz de luz sobre el plano del objeto que se encuentra en la platina. Debajo de él se encuentra el diafragma iris que regula la cantidad de luz que llega al condensador (6).
- Fuente de Luz: es una lámpara que está ubicada en la parte inferior del aparato, en caso de no poseerla debe ubicarse una fuente de luz externa (lámpara incandescente común) aproximadamente a 30 cm. del espejo (6).

     Condensador y fuente de luz

1.6. Características de los objetivos
• Escala de reproducción: relación lineal que existe entre el tamaño del objeto y su imagen, por ejemplo, 4:1, 40:1, 65:1, etc (6).
• Poder definidor: es la capacidad del objetivo de formar imágenes de contornos nítidos (6).
• Limite de resolución: es la menor distancia que debe existir entre dos objetos para que puedan visualizarse por separado. Fig 2 y 3 (6).
• Poder de resolución: es la capacidad de mostrar la imagen en sus detalles más finos. Está en relación inversa con el límite de resolución (6)
 
Figura 2. Comparación de limites de resolución entre microscopio óptico, electrónico y ojo humano. Las principales unidades de medidas usadas en biología celular son el micrómetro y el nanómetro. El cuadro arriba muestra una equivalencia entre esas unidades, comparándolas también con el milímetro. Las flechas indican los limites aproximados de resolución del ojo humano, del microscopio óptico y del microscopio electrónico. (7)
 
 

Figura 3. Tamaños relativos de células

• Poder de penetración: es la propiedad de permitir la observación simultánea de varios planos del preparado. Es inversamente proporcional a la escala de reproducción o aumento (6).
• Distancia focal: es la distancia de la lente frontal al preparado colocado en la platina, cuando está enfocado. Disminuye cuando aumenta la escala de reproducción del objetivo (6).
• Aumento total: Debemos notar que el ocular también tiene un aumento, por lo tanto el aumento total de la imagen que observamos es el producto entre el aumento del objetivo y el del ocular. Ejemplo: si tenemos colocado el objetivo cuya escala de reproducción es 40:1 y nuestro ocular tiene un aumento de 10x, entonces el aumento total será 40 x 10 = 400 (6).
• Apertura numérica (AN): La apertura numérica, es decir la capacidad de reunión de la luz de objetivo (1), también se encuentra grabada en la manga del lente, siendo de 0,30 para el objetivo de x10, de 0,65 para el de x40 y de 1,30 para el de x100 (4).

1.7. Consideraciones para el uso del microscopio de campo blanco
1.7.1. Imagen
Se debe tomar en consideración que la imagen de un microscopio óptico se encuentra siempre “cabeza abajo” y si se mueve la preparación hacia un lado se observa que se desplaza en sentido opuesto, estas características se encuentran siempre presentes en un microscopio óptico y debemos acostumbrarnos hasta encontrarlo normal (1).

1.7.2. Enfoque.
El enfoque de una preparación debe iniciarse siempre con el objetivo de menor aumento (lupa o 10X) ya que estos quedan siempre mas alejados de la platina; se debe subir la preparación con el tornillo micrométrico hasta el tope siempre mirando por un lado del microscopio para evitar que choque el objetivo con la preparación, después mirando a través del ocular se empieza a bajar lentamente la platina hasta localizar el foco, es decir donde la preparación se observa nítidamente  (1).
La mayor parte de los microscopios actuales están parfocalizados, lo que indica que al quedar en foco la lupa, los demás objetivos quedaran también  enfocados, y solo se requiere de un pequeño ajuste del tornillo micrométrico para ver nítidamente la imagen (1)

1.7.3. Empleo del objetivo de inmersión en aceite (x100)
Se deben utilizar preparaciones teñidas completamente secas.  Para esto se pone una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la porción que se va a examinar.  Preferencialmente se deben utilizar aceites sintéticos que no se secan, en vez de aceite de madera de cedro que se seca rápidamente (4).

1.7.4. Determinación de la posición de los objetos observados
El círculo luminoso que se observa a través del ocular se denomina campo microscópico  y los objetos que se observan en el se pueden localizar en relación con las manecillas del reloj (4).

1.7.5. Inversión de las imágenes
Las imágenes son invertidas por los lentes.  De esta manera los objetos que aparecen en el fondo del campo microscópico se encuentran realmente en la parte mas alta y los objetos que se encuentran en el lado izquierdo del campo microscópico se encuentran realmente en el lado derecho (4).

1.8. Preparación de la muestra
 Ya que los microorganismos son transparentes es difícil distinguirlos con este tipo de microscopía y es por lo que se suelen teñir.  (2).

1.8.1. Observación microscópica
Para observar una muestra al microscopio óptico podemos recurrirá a:
- Preparación húmeda. Se realiza colocando una gota de la suspensión de microorganismos entre un porta y un cubreobjetos. Se observa directamente (2).
-  Preparación fijada. Se coloca una suspensión homogénea de microorganismos en una gota de agua sobre el
portaobjetos y se fija (mediante calor o agentes químicos) y después se tiñen mediante diferentes técnicas. Estas preparaciones se observan sin cubreobjetos y, habitualmente, con objetivos de inmersión (2)

1.8.2. Tinciones
Son técnicas que permiten observar microorganismos en función de la capacidad de los mismos para retener (o no) determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la célula y del colorante.

Estos colorantes pueden ser de distintos tipos:
- Catiónicos. Son sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las células y las tiñen. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal violeta, Safranina (2).
- Aniónicos. Con carga negativa. No penetran en el interior celular, de modo que no tiñen las células, sino el entorno. En este caso se habla de tinción negativa. Ejemplos: Eosina, Nigrosina (2)
- Liposolubles. Se mezclan con los lípidos celulares y los tiñen.
Ejemplo: Negro sudán  (2).

Por otro lado las tinciones pueden realizarse siguiendo distintos métodos.
- Simples. Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las células tienen una composición química diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un  colorante. El colorante tiñe las células (Azul de metileno, Safranina) o no (Nigrosina) (2).
- Diferenciales. Se basan en el hecho de que distintos tipos de células tienen distinta composición química, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tinción, lo que permite clasificar los microorganismos en diferentes grupos, según su capacidad de tinción. En este apartado están dos tinciones de importancia taxonómica y médica: la tinción de Gram y la de ácido-alcohol resistencia (de Ziehl-Neelsen). Estas tinciones utilizan más de un colorante (2).
- Selectivas. Se basan en el hecho de que distintas estructuras celulares tienen distinta composición química, de modo que se tiñen selectivamente con ciertos colorantes. Ej; tinción de esporas, de flagelos, de paredes celulares, de corpúsculos metacromáticos. Pueden utilizarse uno o más colorantes (2).

Imágenes Microscopio de campo claro

Figura 4. Células sanguíneas, Células de Traquea y micorrizas VA.

1.9. Bibliografia

1.  Barrera, H y Cárdenas, R. 1997. El microscopio óptico. Editorial Plaza y Valdes, México. Pg 29-30, 34-36, 63-68.

2. Instituto Técnico Profesional Marítimo de Valparaíso. [en linea].  Observación de los microorganismos: el microscopio: preparación y examen de muestras. Dr. Pedro F. Mateos del Departamento de Microbiología y Genética. Facultad de Farmacia. Universidad de Salamanca. <http://www.institutomaritimo.cl/espec/elab/microbio/micro2.html> [Consulta: 31 Jul. 02]

3. Monografias.com. Microscopia. [En linea]. Monografias.com
< http://www.monografias.com/trabajos7/micro/micro.shtml   >
[Consulta: 31 Jul. 02]

 4. Organización mundial de la salud 1983.  Manual de Técnicas Básicas para un Laboratorio de Salud.  Editorial OMS. C. de México, México. Pg. 13-23.

5. Practicas  de biología. I.T.A. Explotaciones agropecuarias. [En linea]. Descripción y manejo del microscopio.
 <http://www.uva.es/docencia/departamentos/cc_agrof/01micros.doc >
[ Consulta: 31 Jul. 02].

6. Anatomohistología. Universidad Nacional del Sur. Microscopia. [En linea]. Microscopia. G.Gigola, Chr.Gatti & J.E.Pérez.
<http://www.anatomohistologia.uns.edu.ar/modmicro.htm>
[Consulta: 01 Ago. 02]

7. Junqueira, L.C, Carneiro José. 1998 Biología celular y molecular. Sexta Edición Ed. Mac Graw Hill. Chile. Pg. 24, 25.

http://www.az-Microscope.On.Ca/main.html
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/anatomy/introduction.html
http://micro.magnet.fsu.edu/primer/index.html

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