7. Modelos experimentales para el estudio del metabolismo cerebro.7.1. Neuronas y glía en cultivos celulares.
El cultivo celular o cultivo de tejidos, como también se le llama, tiene su origen en el siglo XIX, como un método para el estudio del comportamiento de las células animales libres de las variaciones sistémicas ocurridas dentro del organismo durante su normal homeostasis y bajo el estrés de un experimento. Estas técnicas iniciaron con el cultivo de fragmentos no disgregados de tejidos, los cuales restringían la mitosis de las células cultivadas y por tanto su crecimiento. Después se realizaron cultivos con fragmentos disgregados de tejidos, los cuales aumentaban el crecimiento celular en cultivo ya que se utilizaban células dispersas; esto fue un gran avance y provocó una explosiva expansión en esta área desde los años 50s.En la actualidad, pueden cultivarse en el laboratorio células procedentes de una amplia gama de tejidos y organismos diferentes. En un principio, el objetivo principal era el estudio de las propias células, cómo crecen, qué necesitan para su crecimiento, cómo y cuando dejan de crecer. Este tipo de estudios tiene hoy un gran interés científico, por ejemplo, en relación con investigaciones sobre el ciclo celular, el control del crecimiento de células tumorales y la modulación de la expresión genética. Otra área de gran interés se centra en la biología del desarrollo. Los esfuerzos para explicar cómo el gran número de células presentes en organismo maduro derivan de una sola célula a partir de la fertilización han llevado a la búsqueda de modelos experimentales.
El cultivo celular es muy adecuado como modelo para el estudio del desarrollo y la diferenciación, por lo que las líneas celulares que conservan la capacidad de diferenciarse in vitro son objeto de un intenso estudio. Por último, hay cierto tipo de investigaciones que no pueden realizarse sin el cultivo de células, por ejemplo, el trabajo con animales transgénicos, conduce a que organismos maduros expresen genes nuevos, se basa totalmente en las técnicas de cultivo celular para la inserción de genes extraños en las células receptoras. Así mismo, la tecnología de la fusión celular y los ensayos de citotoxicidad son técnicas de cultivo celular que, en cierto modo, han sido diseñadas para sustituir a la metodología in vivo.7.1.1. Biología del cultivo celular,
La validez de un cultivo celular como modelo de función fisiológica in vivo ha sido criticado, ya que se presentan problemas de caracterización por la alteración del desarrollo celular; la proliferación in vitro no se presenta de igual manera a la de in vivo, debido a la reducción de la relación célula-célula y la interacción matriz-célula por la no presencia de la heterogeneidad y la estructura tridimensional de las células hallada in vivo, además porque el medio hormonal y nutricional se ve alterado. Esto crea un ambiente que favorece la difusión, migración y proliferación de células no especializadas, pero no a la expresión de funciones diferenciadas. La provisión de un ambiente apropiado, nutriente, hormonas y sustratos son fundamentales para la expresión de funciones especializadas.En un cultivo celular la mayoría de las células crecidas a partir de un tejido sólido disgregado o de un subcultivo tienen la capacidad de adherirse en monocapa, transformarse o anclarse independientemente. Esta adherencia celular es mediada por receptores celulares específicos de superficie en la matriz extracelular y la dispersión celular podría ser precedida por la secreción de proteínas de matriz extracelular y proteoglicanos por parte de la célula. Las células se pueden anclar y difundir en el vidrio donde se cultivan por medio de ligeras cargas negativas y al plástico, como el poliestireno, si tienen una propiedad o tratamiento con descargas eléctricas o con radiación ionizante de alta energía. El cultivo en vidrio o plástico provee condiciones favorables para el crecimiento y anclaje celular.
El crecimiento de las células en un cultivo celular primario depende de la supervivencia de éstas a las diferentes técnicas de disgregación y a la capacidad de adherirse al sustrato o de sobrevivir en suspensión. Si el cultivo primario es mantenido por pocas horas podría ocurrir un paso de selección futuro. Las células capaces de proliferar podrían aumentar, otros tipos de células podrían sobrevivir pero no aumentar y otras podrían ser capaces de sobrevivir en condiciones especiales. Además el crecimiento celular va ligado al espacio del cultivo, ya que unas células detienen su crecimiento, mientras que otras lo incrementan.7.1.2. Tipos de cultivo celular.
El cultivo de órganos permite la ampliación de un cultivo de células de tejido no disgregadas a un cultivo tridimensional que muestre en algo o en todo las características histológicas de los tejidos in vivo, para esto se utiliza un medio con interfase líquido gaseosa.
El cultivo de cortes de tejido el cual utiliza fragmentos de tejidos colocados en vasos de vidrio o plástico con un medio con interfase líquida que va a promover la migración de las células cultivadas hacia un plano sólido provisto de un sustrato específico para cada célula.
El cultivo de células dispersas en suspensión se refiere al cultivo de células tomadas del tejido original, de cultivos primarios de células o de una línea o cadena celular por disgregación enzimática, mecánica o química, este cultivo necesita de una monocapa adherente o un sustrato sólido que le provea a las células un medio adecuado para desarrollarse.
Se realiza también el cultivo primario en el cual las células han sido reasociadas para recrear la estructura tridimensional del tejido; esto realizado por perfusión y por el crecimiento de una monocapa, la reagregación en suspensión, o la infiltración de una matriz tridimensional como el colágeno. Derivado del cultivo anterior encontramos el cultivo secundario en el cual se cultivan diferentes provenientes de una misma, es el caso de los cultivos de astrocitos donde se puede obtener, en un mismo cultivo, crecimiento de los tipos I y II de éstas células.
En la actualidad se están realizando cultivos que permiten la recombinación de células de diferentes linajes como los queratinocitos de la epidermis en combinación con los fibroblastos de la dermis; a estos cultivos se les denomina cocultivos. Dentro de estos cultivos encontramos los cultivos de neuronas y astrocitos en conjunto, en los cuales se ha confirmado el ciclo de la glutamina-glutamate por medio de análisis de los isótopos del glutamato y la glutamina, donde la glutamina es producto de los astrocitos y el glutamato y el aspartato producto de las neuronas. Además, se ha estudiado el acetato en estas células, el cual es metabolizado por ambas células, neuronas y astrocitos.
El cultivo de células transformadas generalmente se obtiene por la inyección de un carcinógeno, después de una serie de cultivos alternados y pasaje por animales. Estas líneas celulares son capaces de desempeñar sus funciones órgano específicas generalmente durante el período de un año. La forma de estas células depende en gran parte, de las condiciones del cultivo utilizadas. Las células que crecen en cultivos en suspensión son casi siempre redondas con pocas prolongaciones. Sin embargo, cuando las células de origen cerebral crecen sobre superficies planas muestran una diversidad morfológica notable, con prolongaciones celulares y neuritas, que se forman con facilidad, mientras que los cuerpos celulares adoptan una forma alargada.7.1.3. Ventajas del cultivo celular.
Las dos mayores ventajas cuando se utilizan los cultivos celulares son: el control del medio fisicoquímico, a saber, pH, temperatura, presión osmótica, tensión de oxígeno (O2) y gas carbónico (CO2) de las células cultivadas y, las condiciones fisiológicas que deben ser constantes. La mayoría de las líneas celulares requieren para su buen desarrollo de suplementos en el medio en que se cultivan, ejemplo de esto es el suero, el cual provee infinidad de elementos como hormonas y otras sustancias reguladoras.
Los cultivos celulares son realizados con diferentes replicaciones para permitir la conversión de experimentos heterogéneos, cuando se realiza un solo cultivo, en experimentos homogéneos o uniformes, cuando se realizan varios cultivos cada uno con muestra y características de cultivos idénticos. Cuando las replicaciones experimentales sean virtualmente idénticas, la necesidad del análisis de varianza como estadística se reduce.
Los cultivos de células permiten someter a las mismas a una baja y definida concentración de reactivos asegurando un acceso directo en ellas, lo que ahorra en un 90% lo requerido para la inyección del reactivo in vivo, su excreción y su posterior distribución a los tejidos en estudio. Aunque los estudios in vivo resulten más económicos que los in vitro son descartados porque el uso de la experimentación en animales resulta cuestionado en aspectos legales, morales y éticos (Freshney, 1995).7.1.4. Desventajas del cultivo celular.
Las técnicas de cultivo celular necesitan unas estrictas condiciones de asepsia porque las células animales crecen menos rápido que la mayoría de los contaminantes comunes como las bacterias, los mohos y las levaduras. Además las células precedentes de animales no pueden desarrollarse en medios de cultivo, por lo que es necesario agregar a los medios suplementos como suero, plasma y fluidos intersticiales, entre otros para de una manera u otra proveer a las células cultivadas un medio semejante al in vivo (Freshney, 1995).
Una mayor limitación en el cultivo de células es el gasto de esfuerzo y materiales para la producción de una pequeña cantidad de células o de tejido. Los costos de producir células en cultivo son diez veces más que el uso de tejido animal, ya que se invierte bastante en ensayos o procedimientos preparativos que pueden ayudar en la estandarización del proceso reduciendo tiempo de manipulación, volúmenes de muestra, tiempos de centrifugación, etc. .
En los cultivos celulares se dificulta relacionar las células cultivadas con las células funcionales ubicadas en el tejido del cual son derivadas, esto por que en la mayoría de los casos presentan propiedades muy diferentes; para esto es necesario utilizar marcadores de células los cuales van a ser de gran ayuda en el momento de caracterizarlas en cultivo porque van a garantizar que las células crecidas en cultivo son las mismas que se sembraron y no otras. Además, suelen presentarse problemas de inestabilidad genética cuando se realizan varios pases de cultivos de células no transformadas, lo que va a originar una gran heterogeneidad en el crecimiento de las células y en su diferenciación.