2.3. Desarrollo y linaje de las líneas de células clonales
     Las líneas de células inmortalizadas sirven como sistemas de modelo para el estudio del desarrollo neural y restauración de las funciones en modelos de enfermedades neurológicas. Recientemente, mediante técnicas de ingeniería genética se han producido líneas celulares con características específicas gracias a la inserción de genes en una célula inmortal preexistente o mediante la inmortalización de células primarias. Las líneas de células de neuroblastoma y glioma, obtenidas originariamente a partir de células tumorales únicas, suponen una oportunidad especial para investigar las diferencias que existen entra las neuronas y la glía. Las ventajas especiales se refieren a la producción de grandes poblaciones homogéneas de estas células mediante clonación, que pueden cultivarse en condiciones controlables y manipulables (Geller, 1991a). Estas líneas celulares comprenden diversos clonos celulares neuronales tales como la línea C1300, células glíales centrales de las cuales destacamos los astrocitomas C6 y CHB (McMorris, 1973) o células glíales periféricas como, por ejemplo, las líneas tumorales de células de Schwann, RN-2 (Pfeiffer, 1972). Las dos líneas de células clonales, neuroblastoma C1300 y glioma C6, producen un amplio rango de proteínas específicas distintas, lo que destaca su naturaleza esencialmente diferente.

2.3.1. Líneas celulares de neuroblastoma
    La línea de neuroblastoma C1300 fue establecida por Agusti-Tocco, G. y Sato, G. en 1969 por clonación de un neuroblastoma de ratón obtenido en el laboratorio Jackson (Bar Harbor, Maine). Las células tumorales fueron adaptadas a celúlas en cultivo utilizando técnicas de transito alternado animal-cultivo y crecidas en un medio Ham´s F10 suplementado con 15% de suero de caballo y 2.5 % de suero fetal bovino. El clon C1300 tiene en cultivo la apariencia de neuroblastos con procesos elongados que emanan del cuerpo (ATCC, 1992).
    La línea C1300 aparece en cultivo como neuronas maduras y sintetiza las enzimas necesarias para la síntesis de neurotransmisores, principalmente, acetilcolinesterasa (EC 3.1.1.7), dopamina b-hidroxilasa (EC 1.14.2.1), colina acetiltransferasa (EC 2.3.1.6), catecol o-metiltransferasa (EC 2.1.1.6), DOPA descarboxilasa (EC 4.1.1.26) y tirosina 3-hidroxilasa (EC 1.14.3.a) (McMorris, 1973; Waymire, 1978). En células de neuroblastoma C1300, se ha demostrado que al inducir un aumento en el AMP cíclico incrementa específicamente la actividad de la tirosina hidroxilasa y de la dopamina b-hidroxilasa (Waymire, 1978).
    Las células de neuroblastoma C1300 en cultivos muestran propiedades electrofisiológicas esencialmente similares a las neuronas normales. Entre ellas están la generación de potenciales de acción sensibles a la tetrodotoxina así como la sensibilidad a la acetilcolina. En estas células, muchas de las enzimas de la síntesis de neurotransmisores existen y son activas, siendo el AMP cíclico un agente importante en la estimulación y mantenimiento de algunas de estas enzimas. El AMP cíclico estimula así mismo, el crecimiento de neuritas en las células de neuroblastoma en cultivo (Rindler, 1978).

2.3.2. Líneas celulares de astrocitoma
    El clon C6 ha sido aislado de un glioma de rata Wistar inducido por la inyección del carcinógeno N-nitrosometilurea, después de una serie de cultivos alternados y pasaje por animales (Benda, 1968.; McMorris, 1973). Las células fueron cultivadas en medio Ham´s F10 (82.5%) con suero de caballo (15%) y suero fetal bovino (2.5%). Esta línea celular es capaz de desempeñar sus funciones organo-específicas sobre un período de un año y es capaz de producir elevados niveles de actividad de la gliceril fosfato deshidrogenasa cuando es estimulada por glucocorticoides (ATCC, 1992).
    La forma de estas células depende, en gran parte, de las condiciones de cultivo utilizadas. Las células que crecen en cultivos en suspensión son casi siempre redondas con pocas prolongaciones. Sin embargo, cuando crecen sobre superficies planas muestran una diversidad morfológica notable, con prolongaciones celulares y neuritas, que se forman con facilidad, mientras que los cuerpos celulares adoptan una forma alargada (ATCC, 1992.; Benda, 1968).
    El origen glíal de la C6, fue confirmado por la producción de altos niveles de la proteína S-100, el fenotipo molecular más característico del cerebro de los vertebrados y que ha sido encontrado en numerosos tumores cerebrales, tanto de humanos como en otros animales (ATCC, 1992.; Benda, 1968; Gysin, 1980; Pfeiffer, 1970). Se ha sugerido que la S-100 puede tener un papel importante en el desarrollo y fisiología del cerebro (Phillips, 1993), quizás en el control de la actividad de la trombina localizada en el cerebro con propósitos, tales como mitogénesis y diferenciación (Dinhanich, 1991) o en la modulación de la acción de la endotelina-1 sobre las arterias cerebrales (Ehrenreich, 1993).
    Entre las propiedades específicas del glioma C6, están la biosíntesis de proteína S-100 (Gysin, 1980; Phillips, 1993) y la inducción de la glicerol 3-fosfato deshidrogenasa mediante la hidrocortisona (Rindler, 1978). Lo mismo ocurre con la inducción de la lactato deshidrogenasa mediante la noradrenalina, que es precedida por una elevación del AMP cíclico. La movilización de glucógeno glíal mediante la noradrenalina también está presente en estas células  y está mediada por AMP cíclico. Estos efectos resultan de la interacción de la noradrenalina con los receptores b situados en la superficie de las células glíales, ya que los b-antagonistas impiden estas respuestas (McMorris, 1973). Se ha demostrado en líneas de glioma C6-2B que la acumulación de AMP cíclico es inhibida por incremento de la concentración de Ca⁺² en el citosol (Debernardi, 1993).
    En los cultivos de células glíales clonales se ha estudiado la biosíntesis y propiedades de diversas macromoléculas. En este sentido, se ha investigado la síntesis de la proteina S-100 (Gysin, 1980; Phillips, 1993), la de los mucopolisacáridos, glucolípidos y diversas glucoproteínas, demostrandose que son idénticas a las encontradas en el cerebro in vivo.
    La acumulación de proteína fibrilar ácida de la glía (GFAP) es un rasgo característico de la gliosis astrocítica. El (-)-deprenil, un inhibidor específico de la monoamino oxidasa (MAO) (EC 1.4.3.4), disminuye la cantidad de mRNA GFAP en cultivos de glioma C6. Este estudio indica por lo tanto que el (-)-deprenil puede ser utilizado para regular la astrogliosis que sigue a daños en el sistema nervioso central al igual que en algunas enfermedades neurodegenerativas (Li, 1993).
    En la línea celular del glioma C6, con una tasa de crecimiento muy elevada, apenas existen uniones comunicantes (Naus, 1991a). Sin embargo, la transfección de estas células con cDNA de la conexina 43 ( proteína que forma el canal de la uniones comunicantes en astrocitos), inhibe drásticamente su crecimiento (Giaume, 1991a; Zhu y col., 1991). Además, cuando las células del glioma C6 se cocultivan con células de esta misma línea transfectadas con cDNA de la conexina 43, se inhibe la proliferación de las células de glioma C6. Por consiguiente se ha sugerido que la inhibición de la proliferación es llevada a cabo por la secreción de factores inhibidores del crecimiento y que en esta secreción están directamente implicadas las uniones comunicantes (Zhu y col., 1992).
    Los sistemas GABAérgicos han sido investigados en astrocitoma C6 y en neuroblastoma C1300 y comparados con los obserbados en córtex de cerebro de ratón. En las células en cultivo, solamente la actividad de la glutamato deshidrogenasa es igual o mayor que la del córtex cerebral. La actividad de la glutamato descarboxilasa en ambas líneas celulares fue ligeramente menor, mientras las actividades de la GABA-transaminasa y la semialdéhido succínico deshidrogenasa eran sensiblemente menores  a las encontradas en cerebro. A pesar de la disparidad en la actividad enzimática, las concentraciones de GABA, glutamato y a-cetoglutarato son similares en las líneas celulares y en el córtex cerebral. Los farmacos anticonvulsivantes, tales como valproato y aminooxiacetato (AOA) incrementan la concentración de GABA en el córtex, aunque tienen poco o ningún efecto sobre las células en cultivo. Las diferencias en la respuesta de los sistemas GABAérgicos entre el cerebro de ratón y las líneas celulares pueden ser debidas a que las células en cultivo son de origen tumoral y no representan un sistema integrado (Passonneau y col., 1977).
    Recientemente, estudios in vivo, ex vivo  e in vitro  de tumores inducidos en cerebros de rata por inyección de células de glioma C6, usando resonancia magnetica nuclear de carbonos en una (NMR-1D) y dos dimensiones (NMR-2D), ha reportado que el N-acetil-L-aspartato, GABA y N-acetil-L-aspartil-L-glutamato son indetectables en los estudios ex vivo  e in vitro. Se detectan altas concentraciones en el medio ácido de los tumores de alanina, lactato y acetato, además de, aspartato, glutamato, glutamina, succinato y glicina, entre otros. Sin embargo, sólo se detecto en este tipo de células hipotaurina y fosfocolina. Las altas concentraciones de lactato en tumores de cerebro pueden deberse a un aumento de la glucolisis aerobia (Remy y col., 1994).

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