4.1.1.Sustratos neuronales y glíales en la compartimentación

    Un gran número de datos experimentales obtenidos, tanto in vitro como in vivo,  sugieren que existe cierta especialización en el uso de sustratos entre las neuronas y la glía. Glucosa, glutamina, citrato, malato, a-cetoglutarato y alanina parecen ser utilizados preferentemente por la neuronas, mientras que una serie de otras sustancias, que se incluyen directamente en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, como por ejemplo: acetato, piruvato, succinato, aspartato, glutamato, g-aminobutirato (GABA), fenilalanina y leucina que son captadas y metabolizadas fundamentalmente por las células glíales. Este concepto de compartimentación viene apoyado también por los estudios funcionales en los que ha llevado a cabo la estimulación neuronal in vivo.
    Las células glíales suponen aproximadamente la mitad del volumen celular del cerebro. Los astrocitos constituyen una elevada proporción de células glíales y contienen concentraciones de mitocondrias en sus prolongaciones relativamente escasas. Este hecho está de acuerdo con los coeficientes respiratorios altos de los astrocitos que equivalen aproximadamente a los de las neuronas. La oligodendroglía contiene grandes cantidades de mitocondrias, pero menos gránulos de deposito de glucógeno que los astrocitos, y gran parte de su metabolismo está dirigido a la síntesis y recambio de mielina en el sistema nervioso central. Generalmente se consideran como las células glíales más activas desde el punto de vista metabólico y en el cultivo de tejidos muestran diferencias con respecto a las neuronas, tanto en sus propiedades metabólicas como en su capacidad de responder a diversos agentes inductores con formación de AMP cíclico y de enzimas glucolíticas. Así pues, las células glíales están probablemente especializadas en su metabolismo y su actividad es complementaria de las neuronas, que parece estar orientada de forma especial hacia el empleo de glucosa como sustrato. Se ha demostrado que los astrocitos suplen intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos a las neuronas y que estos intermediarios evitan la disminución de estos metabolitos, que podria ocurrir debido a la liberación de glutamato como neurotransmisor a partir de los terminales nerviosos glutamatérgicos.
    La modificación de la concentración de algunos neurotransmisores requiere que los astrocitos posean mecanismos de transporte o bombas para el transporte específico de neurotransmisores o compuestos moduladores tales como el g-aminobutirato (GABA), L-glutamato, L-aspartato, glicina, serotonina, noradrenalina, dopamina y adrenalina. Tanto la glía normal como la transformada pueden acumular estas sustancias debido a la presencia de un transporte de alta afinidad dependiente de la energía y del ión sodio. Los valores de KM están en el rango µM y las células glíales contienen varios de estos sistemas de alta afinidad repartidos por su membrana plasmática. Los astrocitos acumulan tanto GABA como catecolaminas en el interior de la célula, y estos productos son degradados debido a sus altos niveles de GABA-a-cetoglutarato transaminasa (EC 2.6.1.19) y monoamino oxidasa (EC 1.4.3.4). Posteriormente a la acumulación y tras los mecanismos de metabolización, los astrocitos liberarán estos productos acumulados de una forma modificada. La enzima glutamato descarboxilasa (EC 4.1.1.15), que sintetiza el GABA a partir de L-glutamato se halla en las neuronas en mayor proporción que en los astrocitos. El enriquesimiento de glutamato descarboxilasa en los terminales nerviosos implica que el GABA sintetizado en las neuronas sea liberado sinapticamente y después se transporta a las células glíales, donde es metabolizado entrando en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos, no obstante, las neuronas tienen un mecanismo de reabsorción del GABA. En el caso del L-glutamato, es liberado por las neuronas y captado por los astrocitos que tienen glutamina sintetasa (EC 6.3.1.2), producen L-glutamina, la cual se exportara hasta las neuronas donde se convierte posteriormente en L-glutamato y GABA. El esqueleto carbonado del L-glutamato se puede formar en el sistema nervioso central a partir de glucosa, pero siempre que exista la presencia de astrocitos, ya que requiere la piruvato carboxilasa y esta enzima se encuentra ausente en neuronas. La tasa de transporte de L-glutamato es mayor en los astrocitos que en las neuronas; las neuronas perderan L-glutamato en el momento de la exitación y esta pérdida ira acompañada de una captación de este sustrato por los astrocitos. Por otra parte, el flujo de L-glutamina en los dos tipos de células es menor que el del L-glutamato y en las neuronas no corresponde cuantitativamente a la pérdida de L-glutamato. La cinética del transporte de L-glutamato y L-glutamina entre astrocitos y neuronas soporta la hipótesis de que los astrocitos y su compartimentación con las neuronas, controlarán la síntesis y por tanto, la concentración de estos neurotransmisores.
    El que el GABA sea producido solamente por neuronas y la glutamina sólo en las células glíales demuestra directamente la compartimentación a nivel de biosíntesis. Mientras que estas diferencias de localización enzimática son absolutas, es probable que, a nivel de la utilización de sustrato energético, la compartimentación no sea absoluta, sino que refleje intensidades diferenciales de captación y utilización.
    Con la técnica de resonancia magnetica nuclear (NMR), usando glutamato y GABA marcados, se ha encontrado que estos metabolitos son sintetizados principalmente en un compartimento en el cual la glucosa es metabolizada a piruvato, seguido por la descarboxilación a acetil-CoA que entra al ciclo de los ácidos tricarboxílicos. La utilización de glutamina y aspartato indica que una apreciable cantidad de estos aminoácidos son metabolizados en un compartimento en el cual la glucosa es metabolizada a piruvato, seguida de una descarboxilación a oxalacetato. Estos resultados son consistentes con el concepto de que la piruvato carboxilasa y la glutamina sintetasa son enzimas glíales específicas y que son inusualmente acumuladas para su utilización en la compartimentación metabólica en los tejidos del sistema nervioso central (Shank, 1993).
    Durante el desarrollo las enzimas del ciclo del GABA son más activas que las enzimas del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, por esto las neuronas necesitan intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxilicos para llenar las necesidades energéticas y para la síntesis de neurotransmisores, lo que las obliga a establecer una compartimentación temprana con los astrocitos. Durante el estado adulto la relación ciclo del GABA/ciclo de los ácidos tricarboxílicos se invierte.
    El glutamato en el cerebro sirve como reserva de esqueletos de carbono que pueden ser reincorporados o removidos del ciclo de los ácidos tricarboxílicos para regular el flujo de reservas de intermediarios en respuesta a la demanda de energía del tejido. Esta reserva es más grande en neuronas que en astrocitos. El flujo de glutamato desde las neuronas a los astrocitos está relacionado cercanamente con el flujo de glutamina en el sentido contrario. Una de las principales fuentes de nitrógeno para la síntesis de glutamina es la leucina, por una reacción de transaminación. Los astrocitos sintetisan glutamina vía glutamina sintetasa (GS) que sería exportada a las neuronas donde se utilizaría como principal precursor para la síntesis del GABA, además, la otra función de la GS es la detoxificación del NH⁺⁴ en el cerebro. Sin embargo, los astrocitos son incapaces de resuplementar glutamina a una velocidad tal, que ayude a las neuronas a mantener las reservas de glutamato y GABA a niveles homeostáticos, por lo tanto, donan intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos para ayudar a satisfacer estas necesidades de síntesis de neurotransmisores.
    Se ha reportado que las concentraciones de la glutamato deshidrogenasa (GDH) son más bajas en neuronas que en astrocitos, mientras que, la glutaminasa (PAG) es más activa en neuronas (Duce, 1983; Patel, 1982). Por otro lado, las concentraciones de monoamino oxidasa (MAO), GABA-a-cetoglutarato transaminasa (GABA-T) y la semialdehido succínico deshidrogenasa (SSDH) estan más concentradas en los astrocitos. GABA-T y SSDH son mitocondriales. En las neuronas predomina la glutamato descarboxilasa (GAD) y la aspartato aminotransferasa (ASAT). Estas observaciones unidas a la producción y liberación de neurotrasmisores por parte de las neuronas y a la síntesis y liberación de glutamina por los astrocitos, soportan cada vez más la principal hipótesis de compartimentación llamada ciclo de la glutamina.
    Recientemente, se han encontrado dos mRNA GABA-T que puede implicar la existencia de más de una forma de GABA-T. El cerebro contiene dos formas de glutamato descarboxilasa (GAD), denominadas GAD65 y GAD67, son el producto de dos genes y diferente secuencia, ambas son piridoxal fosfato dependientes. GAD65 aparece localizada en los terminales nerviosos y GAD67 está mas uniformemente distribuida por toda la neurona. Un aumento de la concentración de GABA intercelular en neuronas de cerebro de rata, causó una disminución de los niveles de GAD67, mientras que los niveles de GAD65 no eran afectados, lo que demuestra que, GAD67 es fuertemente controlada un mecanismo regulador intraneuronal que tiene importantes funciones fisiológicas en las células GABAérgicas del cerebro de los mamiferos.
    Los astrocitos poseen piruvato carboxilasa (PC), esta enzima anaplerótica mitocondrial convierte el piruvato en oxalacetato, favoreciendo la formación y salida de citrato. En experimentos con resonancia magnetica nuclear (NMR), utilizando [1-¹³C]-glucosa, sólo se ha detectado altas concentraciones de citrato en el medio en cultivos de astrocitos. Estos resultados convertirian al citrato como el más importante constituyente del ciclo de los ácidos tricarboxilicos liberado por los astrocitos para subsecuentemente, ser utilizado por las neuronas (Duce, 1983; Sonnewald, 1991; Sonnewald, 1993a). Sin embargo, se ha demostrado usando [1,5-¹⁴C]-citrato, que la velocidad de la liberación de citrato desde las neuronas de ratón en cultivo primario es solamente 5% más baja que los astrocitos. Sólo la presencia de glutamina, glutamato, bicarbonato y K+, estimula la liberación de citrato en los astrocitos, que es independiente de las concentraciones de citrato exógeno. Además, el [1,5-¹⁴C]-citrato se metaboliza a ¹⁴CO2 a una velocidad ligeramente superior en los astrocitos con respecto a las neuronas, lo que demuestra un contenido intracelular de este compuesto muy similar en los dos tipos de células. La falta de un sistema de absorción saturable para citrato en las neuronas y en los astrocitos, no soportan la idea de compartimentación con respecto a este sustrato. Se ha propuesto que el papel del citrato extracelular controlado por los astrocitos, es el de quelatante de Ca⁺² y Mg⁺². La concentración extracelular de Mg⁺², gobierna la actividad funcional de los receptores NMDA, por lo tanto, el citrato puede influenciar los estados exitables de las neuronas vía regulación de la exitación del glutamato a través de estos receptores (Westergaard, 1994). A pesar de todo, con estos resultados no se puede descartar que el citrato pueda tener un papel importante durante el desarrollo, no sólo como regulador de iones calcio y potasio en el espacio extracelular, sino como un precursor de neurotrasmisores.
    Probablemente existe una clara transferencia de a-cetoglutarato y malato desde los astrocitos hasta las neuronas, haciendo participar al transporte de cetoácidos en los terminales nerviosos por un proceso de captación de alta afinidad dependiente de Na⁺. Estos sistemas de transporte se han demostrado en las preparaciones enriquecidas en terminales nerviosos. La presencia de transportadores para malato y ?-cetoglutarato a nivel de membrana plasmatica, convierte a estos dos intermediarios en candidatos para establecer una compartimentación. Estas observaciones estarían soportadas por el hecho que durante el desarrollo, la lanzadera malato/aspartato es más activa en neuronas que astrocitos, por lo que necesitarian un suplemento de malato y a-cetoglutarato extra para ayudar a mantener la síntesis de glutamato y aspartato en las neuronas. Además, esta lanzadera en neuronas, representa la ruta de síntesis de glutamato más importante que la ruta vía glutamato deshidrogenasa o la vía de la GABA-a-cetoglutarato transaminasa. El glutamato en los astrocitos se degrada más por acción de la glutamato deshidrogenasa que por acción de la aspartato aminotransferasa. Por otro lado, en astrocitos relacionados a células fotoreceptorasla, la glutamato deshidrogenasa se encuentra al doble de concentrada en el citoplasma que en la mitocondria. Esto favorece una degradación del glutamato en los astrocitos. Por otro lado, la producción vía L-aspartato N-acetiltransferasa de N-acetil-L-aspartato es esclusivamente neuronal y está regulada por las concentraciones de aspartato. La formación de a-cetoglutarato en los astrocitos ocurre más por la ruta de deaminación oxidativa que por una transaminación, lo que sugiere que la formación de a-cetoglutarato desde glutamato representa una degradación neta y no un intercambio isotópico.
    El acetato producto de la reacción catalizada por la N-acetil-L-aspartato amidotransferasa, es metabolizado muy lentamente por las neuronas lo que produce una acumulación y liberación al medio de este sustrato. Esto lo convierte el un posible metabolito de intercambio desde las neuronas, favoreciendo posiblemente la lipogénesis en los astrocitos. El acetato puede entrar al ciclo de los ácidos tricarboxílicos vía acetatotioquinasa (EC 6.2.1.1) cerebral, que utiliza como sustratos acetato y CoA para convertirlos en acetil-CoA. Se ha demostrado claramente que utilizando acetato marcado se obtiene preferencialmente glutamina marcada más que glutamato marcado, mientras que, si el precursor es glucosa marcada ocurre lo contrario. Además, el citrato ha sido mucho más marcado cuando el precursor es acetato marcado que cuando es glucosa marcada. Estos resultados indican que el acetato posiblemente es un precursor preferencial para la síntesis de glutamina y citrato que la glucosa, además, refleja un mayor intercambio de intermediarios del ciclo de los ácidos tricarboxílicos en los astrocitos que en las neuronas. Después de la infusión de [1,2-¹³C]-acetato, resultados utilizando NMR indican: que en el cerebro de rata hay dos compartimentos diferentes para glutamato, caracterizados por la ausencia (neuronas) o presencia (astrocitos) de glutamina sintetasa; dos ciclos tricarboxílicos, uno que metaboliza preferencialmente [1,2-¹³C]-acetato (mitocondrial) y otro que utiliza acetil-CoA sin marcar (citosol); un sistema de reciclaje de piruvato, hasta ahora desconocido, asociado al ciclo de los ácidos tricarboxílicos, que metaboliza preferentemente acetil-CoA sin marcar (citosol); una predominante producción de GABA en el compartimento del glutamato donde no esta presente la glutamina sintetasa (neuronas). Estos resultados evidencian que tanto las neuronas como los astrocitos presentan la misma capacidad de absorber acetato.
    La enzima anaplerótica, piruvato carboxilasa, se expresa selectivamente en las mitocondrias de astrocitos, con lo que ofrece una fuente de carbonos. Igualmente, se ha detectado la enzima málica en el citosol y mitocondria de los astrocitos. Bajo este panorama la lanzadera aspartato/malato, sólo puede funcionar en los astrocitos y las lanzaderas citrato/malato y aspartato/malato en las neuronas.
    Por otro lado, la alanina procedente del piruvato por acción de la alanina aminotransferasa (ALAT) (EC 2.6.1.2), ha sido localizada en altas concentraciones en el medio ácido de cultivos de astrocitos, y se ha propuesto como un sustrato candidato a ser compartimentizado. Recientemente se han reportado dos sistemas de absorción de alanina, uno de baja y otro de alta afinidad dependientes de ión sodio en sinaptosomas. La rápida acumulación del complejo Na⁺-alanina en los sinaptosomas estimula la actividad de la bomba Na⁺/K⁺ e incrementa la utilización de energía, esto es, activa la producción de ATP, glicólisis y fosforilación oxidativa. La acumulación de Na⁺ también causa una pequeña despolarización de la membrana plasmática, elevando las concentraciones de Ca⁺² interno y favoreciendo la liberación de glutamato. Estos resultados indican que los astrocitos liberan alanina que es reabsorbida por las neuronas para utilizarla como precursor gluconeogénico durante el desarrollo y como fuente de nitrógeno. Esta observación esta soportada por experimentos con [¹⁵N]-glutamato utilizando cromatografía de gases acoplada a un espectrofotometro de masas. Se encontró que en cultivos primarios de astrocitos se liberó al medio [2-¹⁵N]-glutamina, [5-¹⁵N]-glutamina y [¹⁵C]-alanina. Estos resultados poden en evidencia que, la síntesis de glutamina es solamente una de las rutas importantes en el metabolismo de glutamato en los astrocitos y que el cambio del nitrógeno del glutamato a la alanina puede considerarse como un mecanismo de desintoxicación. Por otra parte, la alanina es una importante fuente de nitrógeno para la síntesis de glutamato en las neuronas, además, todos los aminoácidos no esenciales pueden formarse a partir de alanina, que tendría un papel relevante en el período perinatal, donde se activan los procesos de síntesis de proteinas. Se ha indicado, que la síntesis de glutamato en neuronas GABAérgicas se deriva no sólo vía glutaminasa, sino que también juegan un papel importante las reacciones de transaminación en los cuales la alanina, vía alanina aminotransferasa (ALAT), que está más concentrada en el citosol que en la mitocondria y la serina, han mostrado ser fuentes eficientes de nitrógeno. La velocidad de generación de alanina desde glutamina es casi del mismo orden de magnitud que la generación de glutamato desde alanina. La velocidad de la ALAT es entre 7-8 veces más rápida en dirección a formación de alanina que en dirección al cetoácido, por lo tanto no se le puede considerar un reacción bidireccional. Por otro lado, la formación de piruvato desde alanina, es considerablemente más lenta que la formación de aspartato desde glutamina. La formación de alanina desde glutamato indica que la ALAT esta presente en terminales glutamatérgicos. Sin embargo, cuando los niveles de glutamato caen en el cerebro, la ALAT es una de las principales candidatas para resuplementar glutamato perdido.
    Se ha detectado en cerebro la presencia de dos enzimas que pueden convertir la glutamina en amonio, la glutamino transaminasa K (Gln-TK) mitocondrial y la w-amidasa. Esta ruta se conoce como la vía de la glutaminasa II y es capaz de generar relativamente altas concentraciones de amonio desde glutamina. Es probable que esta vía este limitada por la disponibilidad de a-cetoácidos. La actividad de la Gln-TK está correlacionada con la maduración de los astrocitos. Una combinación de Gln-TK, a-amidasa, GDH con GS resulta en un reciclaje de glutamina y glutamato. El efecto neto es la aminación reductiva de un apropiado a-cetoácido. La Gln-TK transamina todos los aminoácidos aromáticos, incluyendo 3,4-dihidroxifenilalanina (DOPA) y se sugiere que la enzima puede modular la síntesis de neurotrasmisores.
    Las neuronas transmiten señales a las células glíales por liberación de potasio al espacio extracelular durante la actividad neuronal, causando la despolarización simultanea de sus potenciales de membrana. Las células glíales pueden responder metabólicamente a la liberación de potasio, tomando el exceso de potasio, para proteger a las neuronas contra perturbaciones en la concentración extracelular de estos iones. La activación neuronal a causado un incremento de K⁺, incrementando la absorción de ³H-2-deoxiglucosa y la síntesis de glucógeno en células glíales. La estimulación eléctrica como el incremento extracelular de K⁺ incrementa las cantidades de 3H-glucosa incorporada a glucógeno, proteínas y lípidos. El metabolismo del glucógeno en el sistema nervioso central debe ser controlado localmente, ya que las hormonas circulantes no pueden pasar la barrera hematoencefálica. Las células glíales, son selectivamente permeables a los iones potasio y la síntesis de glucógeno mediada por la promoción de iones potasio en el cerebro puede ser un mecanismo para ayudar a mantener el suplemento de energía, como consecuencia de una intensa actividad neuronal, si los niveles locales de glucosa en la sangre caen o son inadecuados. Devolver