Primera Sesión - Miércoles 23 de septiembre

Ponente 1

Adriana Patricia Rojas Moreno

Licenciada en biología y química. Magíster en ciencias de la universidad de los Andes. Doctora en ciencias, mención Biología molecular, celular y neurociencias de la Universidad de Chile. Entre sus temas de interés investigativo se encuentran la regulación transcripcional, la epigenética y la citogenética. Es profesora del  Instituto de Genética Humana de la Pontificia Universidad Javeriana. Profesor Líder del Semillero de Epigenética y cáncer de pulmón.

Abstract

Control epigenético en la diferenciación osteoblástica

Coinvestigadores: Rodrigo Aguilar, Miguel Allende y Martín Montecino.

El factor de transcripción Runx2 es esencial para el compromiso con el linaje osteoblástico. Esta función la realiza mediante el control de la expresión de genes fundamentales en el proceso de diferenciación ósea. La expresión de Runx2 es iniciada desde 2 promotores: P1 distal y P2 proximal, que dirigen la expresión de dos isoformas principales denominadas Runx2-I/p56 y Runx2-II/p57. Se ha demostrado que el promotor P1 controla la expresión de la isoforma Runx2-II en células osteoblásticas y que la estimulación de células pluripotenciales mesenquimales con la proteína morfogenética ósea 2 (BMP2) es capaz de inducir, específicamente, la expresión de esta isoforma. Esta elevada expresión de Runx2 es acompañada por un remodelamiento cromatínico en la región promotora P1, que es independiente de la actividad remodeladora de cromatina de complejos del tipo SWI/SNF, y es mediada por mecanismos epigenéticos; específicamente por la existencia de un patrón específico de modificaciones postraduccionales en las histonas H3 y H4 presentes en la región promotora proximal P1 que está asociado a la actividad transcripcional del gen Runx2-II/p57 en células osteoblásticas. Debido a la importancia que tienen estas modificaciones covalentes en las histonas como un mecanismo de regulación de la expresión de genes maestros para la diferenciación osteoblástica, en este trabajo nos enfocamos en evaluar la contribución de proteínas con actividad metiltransferasa, como MLL2, WDR5 y enzimas con actividad demetiltransferasa como NO66, JARID1B y UTX en la actividad transcripcional del gen Runx2-II/p57.

En este trabajo demostramos que el complejo MLL2/WDR5/UTX estimula la actividad transcripcional del promotor P1 de Runx2 y que esta regulación ocurre por un mecanismo concertado, que favorece el enriquecimiento de H3K4Me3 y el detrimento de H3K27Me3, en el promotor. En contraste encontramos que JARID1B media la represión transcripcional del gen. Esto fue demostrado mediante el uso de shRNA contra JARID1B en células mesenquimales C2C12 estimuladas con suero de caballo, donde encontramos que el silenciamiento de JARID1B resulta en la activación transcripcional de Runx2-II/p57.

Todos estos resultados demuestran que estos reguladores epigenéticos cumplen una función importante durante el control de la transcripción de Runx2; específicamente estableciendo un ambiente epigenético en el promotor P1 que facilita la unión de la maquinaria de transcripción basal en células osteoblásticas y permite el reclutamiento de complejos que median el silenciamiento génico en células no osteoblásticas.

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Ponente 2

Ángela Johana Espejo Mojica

Microbióloga industrial. Ph.D en Ciencias Biológicas de la Pontificia Universidad Javeriana. Entre sus áreas de investigación están la producción y purificación de anticuerpos (IgG e IgY) epítope específicos contra diferentes antígenos y su aplicación en técnicas de inmunodetección; y la producción y purificación de proteínas recombinantes en microorganismos y su estudio en diferentes líneas celulares como potenciales herramientas de uso terapéutico como la Terapia de Reemplazo Enzimático.

Abstract

Expresión de proteínas humanas recombinantes en microorganismos como plataforma para la producción de agentes terapéuticos 

Coinvestigadores: Carlos J. Alméciga-Díaz, Alexander Rodríguez, Ángela Mosquera, Dennis Díaz, Laura Beltrán,Aura Ramírez, Sergio Díaz, Natalia Pimentel,Jefferson Moreno, Jhonnathan Sánchez, Yahir Bonilla, Juliana Lago, Oscar F. Sánchez,Henry Córdoba, Raúl A. Poutou-Piñales, Luis A. Barrera.

Los errores innatos del metabolismo (EIM) son un grupo de enfermedades producidas por la mutación en un gen que codifica para una proteína del metabolismo intermediario, causando la acumulación o ausencia de determinados metabolitos y generando la aparición de diferentes síntomas. Durante los últimos años, la Terapia de Reemplazo Enzimático (TRE) se ha convertido en la principal alternativa de tratamiento para aquellos EIM con alteraciones enzimáticas. La TRE consiste en la administración de una proteína funcional producida de forma recombinante.

Actualmente las proteínas recombinantes aprobadas para uso en pacientes son producidas en células de mamífero. Sin embargo, el uso de estos sistemas de expresión está entre las causas del costo elevado de este tipo de terapias. Con el objetivo de buscar alternativas más eficientes y económicas para la producción de estas enzimas, el Instituto de Errores Innatos del Metabolismo ha trabajado durante los últimos 15 años en la producción de proteínas humanas recombinantes empleando como sistemas de expresión bacterias (Escherichia coli y Lactobacillus plantarum) o la levadura metilotrófica Pichia pastoris. Durante estos años se ha desarrollado un esquema de trabajo que involucra: 1) la selección de clones productores mediante técnicas moleculares y cultivos a pequeña escala, 2) la producción de la enzima a escala de biorreactor (1,65 L), 3) la purificación mediante técnicas cromatográficas (intercambio iónico y exclusión molecular), 4) la caracterización de la estabilidad a pH, temperatura y suero humano, y 5) la evaluación de la captura celular empleando células en cultivo. Para el caso de E. coli se han producido y caracterizado las enzimas N-acetilgalactosamina-6-sulfato sulfatasa (GALNS) e iduronato-2-sulfatasa (IDS), observando que este sistema posee la maquinaria para producir estas enzimas de forma activa y con estabilidades similares a las observadas por las enzimas producidas en células de mamífero. Sin embargo, estas proteínas no son capturadas por células en cultivo, indicando que para este caso específico las N-glicosilaciones son necesarias para la captura celular pero no para la producción de una enzima activa. Por otro lado, en la levadura Pichia pastoris se han expresado las enzimas IDS, GALNS y las tres isoformas de la beta-hexosaminidasa. Al igual que las enzimas producidas en E. coli, estas presentan propiedades fisicoquímicas similares a las observadas en enzimas producidas en células de mamífero. Sin embargo, por tratarse de un sistema de expresión eucariota estas enzimas poseen N-glicosilaciones, que aunque diferentes en estructura, permiten su captura por células HEK293 y fibroblastos humanos, mostrando el potencial de estas enzimas para el desarrollo de una TRE.

Recientemente, se comenzó a trabajar con la bacteria ácido láctica Lactobacillus plantarum, con el objetivo de desarrollar un sistema que permita la administración oral de proteínas recombinantes, lo cual no sólo tendrá un impacto positivo en la calidad de vida de los pacientes y adherencia de la terapia, sino que también permitirá disminuir los costos al evitar muchos de los pasos de purificación de la enzima terapéutica. Con el propósito de lograr que estas enzimas se conviertan en alternativas reales de tratamiento, actualmente se está trabajando en 1) optimizar la producción de las enzimas desde el punto de vista molecular y del bioproceso, 2) identificar nuevos sistemas de expresión, 3) manipular los hospederos para modificar las N-glicosilaciones facilitando la captura celular y disminuyendo el riesgo de respuestas inmunológicas, e 4) identificar proteínas activadoras o ayudadoras. Estos resultados muestran la posibilidad en un futuro cercano no solo de ofrecer otras alternativas para el tratamiento de EIM, sino también de permitir la producción de proteínas recombinantes para el tratamiento de otras patologías en el país.

Ponente 3

César Augusto Ramírez Segura

Biólogo. Doctor en ciencias biológicas de la Pontificia Universidad Javeriana. Sus áreas de investigación incluyen la biología molecular básica y aplicada de tripanosomátidos y sus vectores, la regulación de la expresión génica en leishmania y la biología molecular de tripanosomatido.

Abstract

Estudio de la regulación postranscripcional en tripanosomátidos de interés médico

Coinvestigadores: José María Requena y Concepción Judith Puerta

Los protozoos hemoparásitos de importancia médica de la familia trypanosomatidae como Leishmania spp. y Trypanosoma cruzi, responsables del amplio espectro de formas clínicas de la Leishmaniasis y la enfermedad de Chagas, presentan diferentes estadios morfológicos relacionados con el ambiente en que el parásito se desarrolla. En el tubo digestivo de insectos flebótomos, vectores de Leishmania sp, se desarrollan los promastigotes, mientras que en mamíferos se encuentran los amastigotes al interior de los macrófagos en la vacuola parasitófora. Las formas multiplicativas en los insectos Redúvidos vectores de T. cruzi, son los epimastigotes y, en mamíferos, los amastigotes. Las formas infectivas presentes en el vector de Leishmania son los promastigotes metacíclicos y, en mamíferos, los amastigotes. En el vector de T. cruzi, las formas infectivas son los tripomastigotes metacíclicos y, en mamíferos, los tripomastigotes sanguíneos. Tal diversidad de estadios de desarrollo, más allá de una simple diferenciación morfológica, representa un complejo proceso de adaptación del parásito para evadir la respuesta inmunitaria y desarrollar mecanismos que le permitan invadir y multiplicarse con éxito en las células hospederas.

A pesar de esta variabilidad, las diferentes formas de desarrollo de cada especie de parásito, al igual que todas las células del cuerpo humano, contienen la misma información genética. La anterior afirmación conduce a la pregunta sobre de qué depende y cómo se generan los cambios del parásito en los diferentes estadios de desarrollo. La respuesta a este interrogante se encuentra en una expresión diferencial, propia de cada estadio, cuyo control ocurre en varios niveles, siendo el más común la transcripción (control transcripcional), seguido de la maduración, transporte, localización, estabilización y traducción de los transcritos (control postranscripcional). Mientras que en los mamíferos el control de la expresión génica se da principalmente a nivel transcripcional, en los tripanosomátidos el control opera a nivel postranscripcional.

El control postranscripcional en tripanosomátidos es dirigido por interacciones entre motivos de las regiones no traducidas del ARN (UTR) y factores proteicos que definen el destino de los ARNm en los diferentes puntos de control. Por esto, la identificación de factores que interactúan con regiones UTR de genes importantes para la sobrevivencia de Leishmania sp y T. cruzi, es un campo muy activo de investigación, también muy importante para el descubrimiento de nuevos blancos terapéuticos.

Tomando en cuenta lo anterior, el Laboratorio de Parasitología Molecular de la Pontificia Universidad Javeriana, en conjunto con el Grupo de Regulación de la Expresión Génica en Leishmania del Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, han venido trabajando en el desarrollo de un flujo racional de trabajo con el objetivo de estudiar los mecanismos de control postranscripcional de la expresión génica en tripanosomátidos de importancia médica como Leishmania sp y T. cruzi.

En el contexto anterior, se propone el siguiente esquema de trabajo, I) seleccionar el factor de virulencia a estudiar, para amplificar y clonar las regiones 5´ y 3´ UTR, II) transcribir in vitro cebos de ARN de las regiones 5´ y 3´ UTR, III) obtener extracto de proteínas solubles de las diferentes formas del parásito, IV) tamizar in vitro las interacciones ARN/proteína mediante la técnica ¿pull down¿, separación por electroforesis en 2D y tinción con coomassie G-250. V) analizar los geles de 2D con respecto a controles, seleccionar manchas de interés e identificarlas por MALDI-TOF/TOF. VI) analizar resultados de proteómica por herramientas bioinformáticas y literatura, para definir los factores proteicos de interés, VII) clonar, expresar y purificar las proteínas de interés en condiciones nativas, para su posterior evaluación funcional in vitro e in vivo.

Ponente 4

Juan Carlos Zambrano Bürgl

Médico de la Pontificia Universidad Javeriana donde también realizó especialización en Cirugía Plástica. Su trabajo de grado para Maestría en Ciencias con énfasis en Inmunología lo realizó en modelo murino de trasplante alogénico de piel. Realizó fellowship en Cirugía Maxilofacial en München y Cirugía Onco-recosntructiva de Seno y Microcirugía en Barcelona. Actualmente es el jefe de la Unidad de Cirugía Plástica del Hospital Universitario San Ignacio y Director del Posgrado de Cirugía Plástica de la Universidad Javeriana.

Luz Stella Rodríguez Camacho

Química de la Universidad Nacional con maestría en bioquímica y doctorado en ciencias biológicas. Entre sus áreas de interés investigativo están la inmunogenética, la inmunomodulación y la autoinmunidad. Es profesora del Instituto de Genética Humana de la Pontifica Universidad Javeriana.

Abstract

Efecto de la sertralina en un modelo murino de trasplante alogénico de piel

Coinvestigadores: Sindy M. Muñoz, Manuel A. Franco.

La sertralina (SRT) es un inhibidor de la recaptación de serotonina y es usado ampliamente para tratar la depresión y trastornos psquiátricos. Recientemente se ha descrito su efecto anti-inflamatorio en modelos in vitro y algunos modelos in vivo. Adicionalmente se sabe que tiene un efecto inhibidor sobre los receptores toll (TLR, por su sigla en inglés). En el rechazo agudo a trasplantes de piel y trasplante de tejido compuesto (TTC) se ha descrito una relación entre estos receptores TLR y la respuesta inmune generada. En TTC, los pacientes requieren una terapia inmunosupresora constante para evitar el rechazo, algunas veces con efectos secundarios no deseables. Además los pacientes trasplantados usualmente muestran síntomas de depresión y ansiedad. Dado que la SRT es uno de los medicamentos más utilizados para tratar actualmente la depresión y posee efectos antiinflamatorios, nosotros quisimos evaluar su papel modulador in vitro sobre células mononucleares de sangre periférica (CMSP), por una parte, estimuladas con lipolisacarido (LPS) y evaluando las citocinas secretadas y por otra parte, estimuladas policlonalmente en ausencia o presencia de SRT y evaluando las frecuencias de LT productores de citocinas mediante citometría de flujo. Para la aproximación in vivo, usamos un modelo murino de trasplante de piel alogénico donde ratones C57BL-6 fueron trasplantados con piel de ratones Balb-c. Un grupo de ratones que recibieron el trasplante fueron tratados con dosis de SRT 30mg/kg intraperitonealmente cada 3 días, otro grupo con dosis de 10mg/kg en igual esquema y el grupo control con el diluyente de la SRT.

Encontramos que las CMSP estimuladas con LPS en presencia de SRT disminuyen su secreción de IL-12p70, TNF-¿ e IL-1¿ en comparación de aquellas tratadas con el control.

Las CMSP estimuladas policlonalmente en presencia de SRT mostraron una frecuencia menor de linfocitos T (LT) CD4 productores de IL-2, IL-10 e IFN-¿ y LT CD8 productores de IL-2 e IFN-¿ al ser comparadas con las CMSP estimuladas en ausencia de SRT.

Respecto al modelo in vivo, se realizaron dos experimentos preliminares donde se encontró una reducción significativa de rechazo al trasplante en los ratones tratados con SRT 30mg/kg pero no en los ratones tratados con dosis de 10mg/kg. En los cultivos de esplenocitos murinos estimulados con PMA/ionomicina se encontró una disminución de los LT CD4 productores de IL-2 en uno de los dos experimentos realizados. En conclusión, nuestros resultados apoyan el efecto anti-inflamatorio de la sertralina al modular la producción de citocinas por parte de las células del sistema inmune.

Queda por confirmar su papel inmunosupresor en el modelo murino sobre el rechazo de trasplante alogénico de piel y evaluar si las dosis clínicas formuladas en humanos tienen un efecto inmunosupresor sobre las células del sistema inmune.

Ponente 5

Paola Ayala

Bacterióloga de la Pontificia Universidad Javeriana con maestría en ciencias biológicas de la misma institución. Entre sus áreas de investigación están estudios clínicos y genéticos de enfermedades con componente hereditario, informática médica y bioinformática. Profesora del Instituto de Genética Humana de la Javeriana.

Abstract

PreteP, predicción temprana de la preeclmapisa

En el Instituto de Genética Humana de la Facultad de Medicina de la Pontificia Universidad Javeriana se viene desarrollando una prueba para la predicción temprana de preeclampsia.  A partir de una muestra de sangre de la paciente se puede identificar un marcador predictivo que está presente en plasma. La preeclampsia es una enfermedad propia de mujeres embarazadas que se caracteriza por hipertensión y presencia de proteínas en la orina, lo que genera riesgos al feto y a la madre. Esta enfermedad afecta al 10% de los embarazos en Colombia, de los cuales el 40% lleva a la muerte de las pacientes.

Con el uso de esta prueba se puede detectar la enfermedad a partir de la quinta semana del embarazo, lo que permite una atención médica oportuna tanto para la madre como para el feto antes de la aparición de los síntomas, que generalmente sucede en la semana veinte. En estos momentos, se está buscando financiación para continuar con la validación técnica, para lo que hay que hacer pruebas de especificidad y sensibilidad con un número mayor de pacientes.

Este proyecto se ha venido trabajando en colaboración con el doctor Reggie García, del Instituto de Investigación en Nutrición, Genética y Metabolismo de la Universidad El Bosque. Ha sido ganadora de una mención de honor otorgado por la Fundación Alejandro Ángel Escobar año 2015.

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